悬浮细胞稳定表达细胞株构建：慢病毒感染悬浮细胞一般比较难，且需要更高的MOI，所以构建悬浮细胞稳定表达细胞株需要注意一些细节。这一讲主要从慢病毒如何感染悬浮细胞，感染后如何加压筛选说起，然后对悬浮细胞稳定细胞株构建的主要流程及关键点分析。

注：稳定表达细胞株构建方法

▲THP-1悬浮细胞过表达稳定株

1.慢病毒感染悬浮细胞最佳复数MOI的确定

和第二讲中介绍的方法相同，但病毒感染细胞的方法需要改进，简要步骤如下：

（1）悬浮细胞吹散后计数，调整细胞密度至0.2-1×10⁵/ml（具体接种数量需要参考细胞的大小和增殖速度）；

（2）根据测定的慢病毒滴度，进行病毒的稀释；

（3）MOI设定10、30、50、100；

（4）将稀释后的细胞加入离心管进行离心去除上清，并加入稀释后的病毒；

（5）混匀后将细胞接种于96孔板，同时加入终浓度为8µg/ml polybrene；

（6）将96孔板放入离心机，室温低速（900-1500g）离心1h；

（7）再放入CO₂培养箱继续感染1h；

（8）根据细胞的生长状态可以进行换液或补液；

（9）3天后观察荧光比例判定最近MOI。

注意：

（1）细胞接种的密度，太稀有可能细胞会死亡，太密不利于后面的荧光观察，具体接种量要根据不同细胞的大小和增殖速度来确定；

（2）Polybrene的浓度选择和贴壁细胞一样，有部分细胞需要去摸索浓度；

（3）对于MOI的分组设置，一般悬浮细胞需要增加MOI值，可以根据文献去适当调整；

（4）感染方式，常规方法是低速离心法，但有些实验室没有合适的离心机怎么办？可以选择离心管静置感染法，本实验室也经常使用。可以将病毒稀释液加入离心管混匀细胞后，直接将离心管放入CO₂培养箱，静置10-30min。再将病毒-细胞混合液吸入96孔板继续感染1h。后面方法相同进行换液或补液；

（5）感染体积的问题，本实验常用的是1/2体积感染法，不管是离心法还是静置法，感染的时候病毒液体积为培养体积的1/2。这样能增加病毒的浓度，增加感染效果。后面如果选择补液的话，就可以直接补一半的培养基；

（6）换液和补液的选择，本实验室一般情况选择补液，让病毒持续感染。但如果病毒对细胞的生长有很大影响，则需要进行离心换液。

2.慢病毒感染目的细胞

（1）通过上述实验确定了慢病毒感染目的细胞的最佳MOI，接下来就可以进行稳定细胞株的筛选工作了；

（2）将目的细胞计数后离心去上清，将稀释后的病毒液混匀细胞后接种于24孔板，同时加入终浓度为8µg/ml polybrene。感染体积为终体积的1/2；

（3）将24孔板放入离心机，室温低速（900-1500g）离心1h；

（4）再放入CO₂培养箱继续感染1h；

（5）补加1/2体积的培养基，CO₂培养箱继续培养。

注意：

（1）目的细胞的接种密度需要根据不同细胞进行调整；

（2）Polybrene的浓度根据不同细胞去调整；

（3）对于极难感染的细胞，可以进行重复感染，即第一次感染后48h再重新进行病毒感染。这样可以增加病毒感染细胞的机率；

（4）如果病毒对细胞生长没有太大影响的话，建议补液，让病毒持续感染。

3. 加压筛选（步骤和稳定表达细胞株构建相同）

（1）细胞感染病毒48h后，荧光显微镜下观察荧光细胞比例；

（2）对24孔板细胞进行分孔，分成3-5个孔，过夜培养；

（3）根据包装的慢病毒载体上的筛选抗生素，进行加压筛选，这里以嘌呤霉素为例；

（4）不同细胞对嘌呤霉素的敏感程度也不一样，所以需要设浓度梯度。本实验室的经验是从1µg/ml到10µg/ml去设立3-5个浓度梯度；

（5）再培养24-48h后观察细胞的死亡情况，选择最佳的嘌呤霉素浓度孔细胞进行后续实验；

（6）后期根据细胞的生长速度和生长情况，可以适当增大或减少嘌呤霉素的浓度；

（7）待细胞长满后进行扩大培养，用于检测目的基因的过表达或者干扰情况；

（8）检测正确后进行细胞的培养冻存。

注意：

（1）有些病毒感染悬浮细胞，荧光观察时间会延长到72h或96h，并且荧光比较弱，需要耐心仔细观察；

（2）可以先确定嘌呤霉素对目标细胞的最佳杀伤浓度，便于指导后面的嘌呤霉素浓度梯度设定；

（3）悬浮细胞死亡后，刚开始不易观察，需要耐心仔细观察。换液时需要进行离心，如果细胞大量死亡，不易离心收集细胞可以进行不断补液，待细胞长多后再进行离心换液；

（4）特别是感染效率低的情况下，荧光细胞也很少，这种情况会导致加嘌呤霉素后，几乎活细胞就没有几个。出现这种情况，首先需要确定病毒包装是否有问题，再者就是调整感染方法，可以进行多次持续感染；

（5）悬浮细胞的单克隆细胞株比较难，因为单个悬浮细胞不易生长，重点是不易观察。如果需要构建单克隆的悬浮细胞株，方法可以参考上一讲稳定表达细胞株构建中的稀释方法。

灵思生物目前已经完成了多种稳定细胞株的构建，包括人、鼠、猪、犬等多物种，也包括悬浮细胞的稳定株，和lncRNA的稳定细胞株。同时构建了能分泌表达蛋白的稳定细胞株，为真核蛋白的大量表达带来便利。

后期我们会不断分享实验过程中的一些小细节、小问题、小技巧等，欢迎大家一起来讨论。

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