1    样本类型

单细胞转录组可接受样本类型如下：

 2、单细胞转录组备样注意事项

2.1 新鲜样本

2.1.1 血液

所有操作均需在无菌条件下进行，新鲜全血样本至于抗凝管中，人不少于 4mL，鼠 1-2mL，如样本量足够建议首次寄送时同一样本 2-3 管重复， 以备份。如样本量足够建议首次寄送时同一样本 2-3 管重复， 以备份。

2.1.2 新鲜组织

直接寄送新鲜组织样本，由客户进行目标组织取样，我们进行目标组织解离，采用组织 保存液保存新鲜组织进行寄送（美天旎组织保存液，货号 130- 100-008 ，客户可自行购买或联系实验室寄送），客户需标明样本名称、组织类型、离体时间、浸入组织保存液时间。

取样量如下：

2. 1.3 植物样本

植物叶片，茎，根，根分生区（非木制，非含淀粉的根茎）， 目标组织量>2g；植物细 胞原生质体解离的成功对植物的生长状态有较高要求，为确保植物取样部位新鲜，建议把生 长状态良好的活体植株直接运输至实验室，取材前与实验室技术人员沟通好具体的取材部位和注意事项。

2.1.4 新鲜组织样本运输

寄送时装有样本的储存管不能和冰袋直接接触，需用泡沫包裹，保证 4℃左右的低温环 境；冰袋寄送，注意不要选择干冰， 以免造成样本结冰，导致样品局部冻伤而使细胞失活， 务必保证在 48 小时内到达单细胞样本接收室；植物活体邮寄可以使用木架固定培养瓶及幼苗， 以保证运输途中植物完整性及状态的稳定性。

2.2 悬液样本

2.2. 1 单细胞悬液

细胞量尽量保证在 1× 106cells  以上 ，如需流式分选 ，分选后目的细胞尽量保证在 1 × 105cells 以上（寄送前提前联系） ；细胞活率≥80%（DeNovix® CellDrop FL  细胞计数仪 计数，或血求计数板用显微镜判断）。细胞形态要求细胞大小均一，直径介于 7-40µm（注： 对于非人、 鼠物种请提前沟通客户样品的细胞大小，若细胞直径过小（<7µm）请确定客户 是否有能准确计数及检测活率的方法及仪器）；细胞团及碎片杂质<5% ，无明显的细胞碎片和细胞团，若有红细胞，需进行裂红处；不能存在反转录抑制剂，即不含有 Ca2+和 Mg2+。

2.2.2 原生质体悬液

要 求 样 品 的 原 生 质 体 数 量 大 于 1× 105  个 ， 建 议 达 到 1× 106  个 ； 原 生 质 体 浓 度 1 × 105- 1.2 × 106/ml ，如浓度过低需要进行浓缩收集，可能影响最终的原生质体数量；要求制 备的原生质体活细胞数量在 80%以上（DeNovix® CellDrop FL  细胞计数仪或 FDA  荧光显 微镜检测）；要求原生质体直径小于 40 μm ，大于 40μm  需要处理为细胞核才能上机；细胞培养基及缓冲液不能含有 Ca2+和 Mg2+等影响酶活性的物质。

2.2.3 悬液样本运输

冰袋寄送（注意不要选择干冰），寄送时装有样本的储存管不能和冰袋直接接触，需用泡沫包裹，保证 4℃左右的低温环境；寄送时间小于 2 小时（悬液样本仅支持同城寄送）。

2.3 冻存样本

2.3.1冻存细胞样本

分离的细胞梯度冻存（程序降温仪或者异丙醇-80℃过夜后液氮保存）；建议冻存密度3-6 × 106cells /mL(管) ，每管 1mL；如细胞量足够建议首次寄送时同一样本 2-3 管重复，以作备用；细胞复苏后活率大于 75%将直接进行上机，活率小于 75%的细胞不建议上机；如样本珍贵，和客户沟通后，由客户决定是否上机。

2.3.2 冻存组织样本

一般组织建议 0.2g-0.5g/管（如需进行流式分选，0.6- 1g/管，不同组织有差异） ，如样 本量足够建议首次寄送同一样本 2-3 管重复，以作备用；若穿刺样本量少，则不质控直接抽 核，需要提前告知客户风险性；植物冻存组织样＞4g 为宜；梯度降温盒-80℃保存（推荐异 丙醇冻存盒），24 小时后选择干冰寄送或者液氮保存（冻存组织样本只可进行单细胞抽核实验）。

2.3.3 冻存样本运输

注意样品运送前保存在-80°C  冰箱，取出后立即置于干冰箱中。使用厚度 4cm  以上的泡沫箱包装，10kg  以上的干冰运输。样品保存期间切忌反复冻融。

3   风险提示

以下任何一种情况出现，样品将判定为不合格，相关影响及风险说明如下：

(1)  组织样品未在 2-8℃组织保护液中保存及运输，或在合格条件下保存时间过长（超过 48h）将影响细胞活率。可能导致细胞基因表达特征变化，数据失真。

(2)  细胞直径过小（<7µm）或过大（>40µm）

(3）DeNovix® CellDrop FL  细胞计数仪检测细胞大小范围介于 7-60µm，细胞过小可能会导 致细胞计数不准，影响最终获得的有效细胞数，需要客户自行准备能够准确计数及测活率的 仪器。细胞直径>40µm  的细胞会堵塞 10x chip  微流控管道，可考虑抽核建库，但是抽核建库样本检测的基因数可能偏低；有效数据占比可能偏低。

 (4)  经去死细胞处理后，细胞活率仍低于 80%（DeNovix® CellDrop FL  细胞计数仪计 数）。可能影响最终获得的有效细胞数。可能导致有效的 Reads  数低（分析结果中的 Fraction Reads in cell），因为细胞处于死亡或者凋亡状态，细胞碎片、杂质以及游离 RNA  都会导致 背景噪音中 Read  比例升高，相应有效细胞中 Reads   比例就低。细胞活性低表明 mRNA  降 解，mRNA  降解导致基因检出少，同时死亡细胞释放大量 RNA  到环境中，导致正常细胞 与背景噪音的强度接近，使得有效细胞也无法根据阈值筛选出来。样本处于死亡或者凋亡状态，此时线粒体基因组会被测到一定比例。

 (5)  经过滤、清洗等处理，细胞悬液中仍有>5%的细胞团、颗粒或杂质，可能堵塞微流 控通道，导致获取的有效细胞数偏离预期；可能导致有效的 Reads  数低（分析结果中的 Fraction Reads in Cell），因为细胞处于死亡或者凋亡状态，细胞碎片、杂质以及游离的 RNA都会导致背景噪音中 Read  比例升高，相应有效细胞中 Reads  比例就低。

 (6)  细胞悬液中细胞浓度低于 100 Cells/µL ，低出细胞计数仪量程范围。致使无法细胞计数，导致获取的有效细胞数严重偏离预期。

 (7)  经必要的过滤和去除死细胞处理后，细胞悬液浓度低于所需浓度。导致获取的有效细胞数可能低于预期。

 (8)  制备细胞悬液时所用 PBS  含有 Ca2+和 Mg2+ 。Ca2+和 Mg2+会影响反转录过程，导致建库失败。

 (9)  包埋组织切片的形态学特征要完整，无大的裂痕、气泡、褶皱等；FFPE 切片对 RNA的质量要求 DV200>50% ，OTC 包埋组织切片后的 RNA 完整性要求 RIN≥7。

上述因组织或细胞悬液不合格而可能导致测序数据不符合预期或项目失败的风险，需客 户提前知情，在项目进行过程当中，在发现（不限于）上述不合格情况时，实验人员会第一 时间反馈技术支持，由技术支持与客户取得联系并充分说明现象和相关风险，经确认后继续 完成实验。组织提取时可能受到上下游处理操作的影响，因此较难保证单次提取满足质量要求，客户应在寄送组织样品前进行备份。为了保障获得高质量的核酸，请务必按照送样手册所规定的准备样本。对珍贵样本或者微量样本，建议自行提取。

4、样本寄送须知

4.1 寄送准备

由于 10x 单细胞转录组建库实验的特殊性，请于样品寄送前 3  天沟通预约，以便进行 实验安排。样品寄送时应采用 WHO 提出的三级包装系统，第一层容器：装样品，要求防渗 漏；第二层容器：要求耐受性好、防渗漏，容纳并保护第一层容器；第三层容器：运输用， 最外层包装。24 小时内能够到达，干冰重量不得低于 5kg；48 小时内能够到达，干冰重量  不得低于 10kg；72 小时内能够到达，干冰重量不得低于 15kg 。样品寄出后请及时告知快递信息。

4.2 试剂耗材说明及注意事项

新鲜样本采用组织保存液保存（美天旎组织保存液，货号 130- 100-008）客户可自行购 买或提前联系实验室寄送，组织保存液 2-8℃保存，不可冷冻，使用时始终置于碎冰（4℃) 上。需冻存样本可加入冻存液（可自己配置，冻存液配制：80%DMEM+10%FBS+10%DMSO或联系公司寄送）冻存。所用耗材（离心管或冻存管）需保证无菌。

 5 、寄送地址及联系人

寄样时请填写完整的样品信息单，用自封袋密封后随样品一起寄送，样品运送：