微生物测序环境和医学样本采样操作指南

1 样本准备基本原则 

1.1 代表性原则 

取样的代表性关系到实验结果是否具有科学意义，因此应根据实验目的慎重选取取样方 案。应从表型、生理指标、环境指标等多方面对样本进行相关鉴定及筛选。 

1.2 准确性原则 

代表性样本的各种特征数据必须被准确记录，并按要求（低温、迅速）采集、制备、贮存 以 及运输，最终正确地按实验设计进行实验和数据处理。 

1.3 及时性原则 

样本质量是影响实验结果的最关键因素，因此用于研究的样本在采集、制备、贮存以及运 输 过程中应尽可能地做到迅速，最大限度的缩短从样本采集到实验的时间。 

1.4 低温原则 

对于所取样本离体后，应尽快置于液氮中速冻、之后保存与干冰或-80℃冰箱中，并保证 在实验进行前避免出现冻融现象，以避免 DNA 降解。 

1.5 重复性原则 

生物学重复的取样应尽量减少重复间样品的差异。在条件允许的前提下，做到重复样本在 取 材时间、部位、处理条件等方面尽可能保持一致，否则可能会影响实验结果的重复性和可信 度。一般要 求样本生物学≥3 个，临床样本≥10 个。 

1.6 安全性原则 

为保证实验室及实验人员的安全，不接收对人具有致病性、传染性的样本（如受人源病毒、 烈 性细菌等感染的动物细胞、组织、血液等）。 武汉灵思生物技术有限公司 027-63493808 www.lingsibio.cn 湖北省武汉市东湖新技术开发区花城大道8号软件新城三期D2栋4层

2 环境样本采集操作指南 

2.1 常规土壤类样本取样方法-农田/森林/草原土壤类 

送样量：扩增子 0.5-3 g，宏基因 1-3 g； 

2.1.1 取样方法 按实验设计确定采样范围，取样器具需事先消毒灭菌处理。采样时应去除地表杂质，根据 需要 挖取相应深度（如 5~20 cm）的土壤，置于冰上运至实验室。去除可见杂质，建议过 2 mm 无菌筛 网。同一样方多点样本等量混合均匀后保存无菌 EP 管中，立即进行液氮速冻，置于-80℃ 保存，或置 于干冰寄送至我司。 

2.1.2 取样点 

注意：建议戴一次性手套、口罩，进行严格取样和操作，尽可能减少人为的污染。

2.2 根际土壤类样本取样方法-作物/蔬菜/草木根系等 

2.2.1 作物类（含草地等矮小植物）根际土壤取样方法 送样量：扩增子 0.5-3 g，宏基因 1-3 g； 

（1）采集植物植株，去除根部大块土壤，置于冰上运输至实验室； 

（2）晃动根部，去除根部松散的土壤后，使用无菌刷子从根部收集残留土壤，过 2 mm 无菌 筛网； 

（3）同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后保存无菌 EP 管中，立即进行液氮速冻，置于 -80℃保存，或置于干冰寄送至我司。

2.2.2 林木类根际土壤取样方法 送样量：扩增子 0.5-3 g，宏基因 1-3 g； 

（1）采集地面下 10-20 cm 根际土壤，置于冰上运输至实验室； 

（2）过 2-5 mm 孔径无菌筛网； 

（3）同一样方多点取样土壤样本等量混合均匀后保存无菌 EP 管中，立即进行液氮速冻，置于 -80℃冰箱保存，或置于干冰寄送至我司。 

注意：取样器具请事先消毒灭菌处理。若为真菌根际土壤，请务必尽可能去除菌丝体残留，减少真菌对 DNA/RNA 提取的干扰。 

2.3 植物内部微生物取样方法 

送样量：扩增子重量 ≥ 1 g；宏基因组重量 ≥ 2 g。 根据研究目的选取对应的新鲜植物组织，进行植物组织表面无菌化处理。 

植物组织表面消毒具体操作如下： 

（1）根据研究对象选取新鲜植物组织（如果是植物根部，需去除根表粘附土壤）；0℃以下运 回 实验室； 

（2）根据组织大小剪成小块或小段（至少两边不超过 0.5 cm），在无菌工作台内，用无菌水对 植物组织进行洗涤 30 s； 

（3）表面无菌化处理： 第一次消毒：75%无水乙醇浸泡 1 min；第二次消毒：2%次氯酸钠处理 3 min，转入 75%无水 乙醇浸泡 30 s，接着用无菌水漂洗 3 次； 

（4）表面无菌化的植物组织，立即进行液氮速冻，置于-80℃保存，或置于干冰寄送至我司。

注意：优先选用新鲜采集的样品送样；根，茎，果实组织较大时，切碎后送样。  

2.4 水体样本 

送样量：扩增子直径 3-4 cm 滤膜 1-2 张；宏基因组直径 3-4 cm 滤膜 1-3 张； 依据研究目的进行确定水体的取样深度和范围；采样后进行滤膜过滤，选择合适孔径的滤 膜， 对于澄清水体或者略浑浊水体，选用 0.22 μm 或者 0.45 μm 的滤膜，取样体积大于 5 L； 对 于浑浊水体，建议先用大孔径的滤膜过滤一遍，再用小孔径的滤膜过滤；将滤膜置于冻存管 中，立 即进行液氮速冻，置于-80℃保存，或置于干冰寄送至我司。 

注意：根据水体中微生物含量不同，取样量有所不同：污水等菌群丰富的水体用量一般为 200-1000 ml，湖泊、河流等自然水体一般为 1-2L，自来水等菌群含量较低的水体则一般为 1-5 L， 海洋水体随 着地理位置、季节和取样深度浮动较大。 

2.5 活性污泥与水体/地表沉积物类样本取样方法 

2.5.1 活性污泥 送样量：扩增子 5 ml（0.5-3 g 沉降物）；宏基因组 10 ml（1-3 g 沉降物）；

 从活性污泥装置中取出悬浮污泥样本，保存无菌 EP 管中，立即进行液氮速冻，置于-80℃ 保存，或置于干冰寄送至我司。 

注意：若液态污泥样本沉降物较少，可适当增加取样量。 

2.5.2 水体/地表沉积物 

送样量：扩增子 5 ml（0.5-3 g 沉降物）；宏基因组 10 ml（1-3 g 沉降物）； 

取距离水底/地表 0-10 cm（具体按实验需要而定）的沉积物，保存无菌取样袋或 EP 管中， 立即进行液氮速冻，置于-80℃保存，或置于干冰寄送至我司。 

2.6 空气样本 

送样量：扩增子直径 3-4 cm 滤膜 1-2 张；宏基因组直径 3-4 cm 滤膜 1-3 张。 

（采样使用的工器具要每天进行更换，并且使用 75%的酒精进行洗涤） 

（1）收集目标区域的空气微颗粒，采用不同孔径大小的无菌滤膜进行目的颗粒的筛选，如果 不分颗粒小大，可直接选取最小孔径的无菌滤膜进行过滤，以保证空气微生物最大程度上都被 过滤下 来； 

（2）将过滤好的无菌滤膜迅速密封，置于-80℃条件下进行保存；

 （3）截取适当大小的滤膜放在含有 1×PBS 缓冲液的 50 mL 离心管中，于 4℃条件下， 用200g 加速度离心 3 h； 

（4）最后温和漩涡处理，使用 0.22 μm 的 Supor 200 PES Membrane Disc Filter 过滤重悬液 后待提取。 

3 医学研究样本采集操作指南 

3.1 粪便样品 

送样量：扩增子小鼠 3-5 粒，人 0.5-2 g；宏基因组小鼠 3-10 粒，人 0.5-2 g； 

（1）尽量避免尿液污染粪便，可以事先排尿，粪便尽可能排入洁净干燥容器内； 

（2）用采样管中无菌勺挖取粪便中段没有接触空气和地面的部分，挖取一满勺。小鼠至少 3-5 粒粪便； 

（3）将挖取的粪便连同小勺一同放入采样管中，盖紧盖子。样品立即进行液氮速冻，置于 -80℃保存， 或置于干冰寄送至我司。 

注意：

a) 取样前三个月内不能使用抗生素；

b) 需剔除其他（已被广泛认可）与肠道微生物相 关疾病的患者，如糖尿病，肥胖，心血管疾病，自闭症、免疫缺陷症等；若目标患者有其他并发症， 需详细记录；

c) 正常组与疾病组的年龄分布，性别比例、地域分布不能存在显著差异。

3.2 肠道内容物样品采集 

送样量：扩增子 0.5-2 g；宏基因组 0.5-2 g； 

（1）待 实 验 对 象死 亡 后 ， 在 无 菌 操 作 台或 灭 菌 环 境 下 用 无 菌解 剖 刀 取 出 整 个 肠 道， 切 取所需肠段； 

（2）用无菌手术刀挖取内容物，分装至无菌离心管中， 整个操作在冰上完成； 

（3）分装好后立即进行液氮速冻，置于-80℃保存，或置于干冰寄送至我司。 

3.3 肠道粘膜微生物样品采集 送样量：

扩增子 0.2-0.5 g；宏基因组 0.5-1 g； 

（1）实验操作在无菌条件下进行，将整个肠道移出体外，将肠系膜的对面纵向切开，使肠腔外； 

（2）用无菌生理盐水清洗肠腔，直到没有内容物流出； 

（3）用无菌载玻片轻刮肠道粘膜（避免穿透基底膜）移至无菌离心管，立即放入液氮冷冻，并在 -80℃冰箱保存，或置于干冰寄送至我司。 

注意：由于肠道黏膜微生物收集要求较多，而采集到的黏膜微生物比较少，建议重复上述步骤多 次，但必须在无菌环境下操作，保证足够取样及保存。

3.4 口腔微生物样本取样步骤 

3.4.1 唾液 

送样量：扩增子 1-3 ml；宏基因 3-5ml； 

在采样前 30 min 内，请勿进食、饮水、吸烟或嚼口香糖；用饮用水将口腔内的杂物洗漱 干净。 

方法 1：采样对象保持口中唾液 1 min 中以上，吐到灭菌后的离心管中，重复这个过程多次， 直到收集的唾液量足够，唾液收集管液氮速冻，用自封袋封存，-80℃保存，干冰寄送。 

方法 2：用商业化唾液采集管（SARSTEDT，德国）取样，采样管液氮速冻，用自封袋封存， -80℃保存，干冰寄送。 

3.4.2 口腔组织 送样量：

扩增子 1-3 个拭子；宏基因 3-10 个拭子； 

采用无菌棉拭子刮取，刮取后棉拭子头剪下放入 2-5 ml 灭菌冻存管，液氮速冻， -80℃保存。取样前棉拭子可用无菌生理盐水或 PBS 润湿，以增加微生物附着率。

具体 部位可参看以下： 

（1）舌背部：刮取舌中心 1 cm2 的部位，约 5 s； 

（2）上颚：刮取整个坚硬的上颚，约 10 s； 

（3）口腔粘膜：刮取左侧和右侧的整个口腔粘膜区，每侧约 10s，要注意不要接触到牙齿； 

（4）角质化的牙龈：刮取颚前方的牙龈，约 10 s； 

（5）腭扁桃体：分别刮取左侧和右侧的腭扁桃体 5 s； 

（6）咽喉：由于条件反射，这个部位非常难收集，若需要取，建议取完别的部位后再取。 慢 慢地将拭子放入咽部后方，约 5 s，注意不要刮到扁桃体；

 （7）龈上牙菌斑：记录取样牙齿，如臼齿，前臼齿，门牙。先干燥取样的部位，用棉拭子 刮 取尽可能的牙菌斑； 

（8）龈下牙菌斑：与龈上牙菌斑处理方式相同，注意清除残留的龈上牙菌斑，并注意要丢 弃 有出血的样本。 

3.5 生殖道微生物采样步骤 

送样量：扩增子 1-3 个拭子；宏基因 3-10 个拭子；

（1）48 h 内无性行为，不得进行私处清洗、上药等改变菌群结构的行为，30 天内不能 用抗生素和抗真菌类药物； 

（2）常规无菌操作消毒外阴或尿道口，用扩阴器扩张阴道； 

（3）用无菌棉拭子拭取宫颈口或宫颈后穹窿分泌物，尽量不碰及阴道壁，圆周滚动 5 次， 放 入无菌拭子管中（可不添加缓冲液）；用剪刀将棉签头剪入冻存管中，每个样本至少 2 个 棉签头（所有器具需要灭菌），液氮速冻； 

（4）样本珍贵，需进行多管备份保存。样品液氮速冻后置于-80℃保存或干冰寄送给公司。

3.6 肺泡灌洗液收集 

3.6.1 大鼠、小鼠肺泡灌洗液

 灌洗液体积：大鼠 10-15 ml，小鼠 2-3 ml； 

一般为颈部和胸部解剖，气管和一侧肺叶结扎。再用穿刺针插入气管上端，生理盐水 或 PBS 反复冲洗，一般为 3 遍，每遍冲洗次数根据需要决定，3-5 次即可，具体操作参考： 

（1）操作所需的设备（除了一次性注射器，气管插管是已经灭菌的，其他设备都需要高压 灭 菌）； 

（2）大鼠麻醉并固定，颈部去毛并消毒，从颈部正中切口；暴露剥离气管，并在气管近端 穿线打 活结，活结要比较松；在所打活结的远端，剪开气管的 1/2，行气管插管，插入后线打 死结； 

（3）用 5 ml 注射器抽取的灭菌生理盐水（常用的大鼠肺泡单次灌洗量为 3-5 ml，小鼠为 0.2-1 ml），通过气管插管注入气管内，反复抽吸三次， 将液体抽出，放入灭菌离心管内。再次抽取生理盐水，重复上面的操作两次，合并三次获 得的液体； 

（4）8000-12000g，4℃，离心 15 min，弃上清，取沉淀液氮速冻后 -80℃ 冻存备用 或干冰寄送至公司。 

Refer：龙隆, 赵显莉, 谭红, 等. 大, 小鼠支气管肺泡灌洗术的研究进展[J]. 中国比较医学 杂志, 2017, 27(12): 115-119.

3.6.2 人肺泡灌洗液（BALF） 

灌洗液体积：100-300 ml； 

（1）1%的利多卡因对患者进行口咽部局部麻醉，静脉推注咪达唑仑 5 mg； 

（2）患者取仰卧位，予吸氧、心电血压监测； 

（3）用支气管镜行支气管肺泡灌洗术，经气管镜活检孔注入 1%利多卡因局部麻醉，将气 管镜嵌入右肺中叶或左肺上叶舌段的一个亚段，共滴注 100-300 ml 无菌等渗盐水进行液 体标本的收集，尽快 4℃ 运送回实验室； 

（4）收集的灌洗液采用 0.22 μm 滤膜过滤，收集滤膜 -80℃ 冻存备用，或干冰寄送给公 司。 

3.8 痰液样品采集 

送样量：扩增子 0.3 g；宏基因：1 g； 痰诱导实验注意事项： 

（1）诱导盐水必须高压灭菌； 

（2）用灭菌镊子分离痰栓以减少唾液污染（在无菌的生物安全柜中操作）； 

（3）收集至 0.3 g 以上痰组织，放入灭菌 EP 管中，立即进行液氮速冻，置于-80℃保存， 或置于干冰寄送至我司。 

3.9 胆汁样品 

送样量：扩增子 2-5 ml；宏基因 5-10 ml； 

患者胆总管胆汁在进行 ERCP 手术时收集，使用严格无菌的侧视内窥镜进行 ERCP 手术， 在将内窥镜由嘴经十二指肠放入胆总管吸取胆汁之前，内窥镜的操作孔道通过避免 任何吸入操作来避免污染。在打入造影剂前，使用通过操作孔道的无菌的括约肌切开器导管从胆 总管中抽取 3-5 ml 胆汁置于无菌管内，离心，弃上清，取沉淀液氮速冻后放-80℃保存， 干冰寄送给公司。 

3.10 乳汁样品 

送样量：扩增子 3-5 ml；宏基因 5-10 ml； 

（1）洗净双手，母乳期用无菌水擦拭乳头，弃掉第一管后，取乳汁 3-5 ml； 

（2）13000rpm，4℃，离心 30 min，弃上清，取沉淀液氮速冻后-80℃冻存备用或干冰 寄送公给司。

  3.11 腹水样品 

送样量：扩增子 10-20 ml；宏基因 20-40 ml； 

（1）收集腹水 10-20 ml 于无菌离心管中； 

（2）13000rpm，4℃，离心 30 min，弃上清，取沉淀液氮速冻后-80℃冻存备用或干冰 寄送给公司。

  3.12 尿液 

送样量：扩增子 30-50 ml；宏基因 50-100 ml； 

应在取样前 5 天内停用抗生素。 

（1）采集中段尿液于无菌杯中；（中段尿：在排尿过程中，弃去前、后时段排出的尿液。） 

（2）一般留取清晨第一次尿液，最好憋尿 6 小时后，将晨尿的中段尿收集至无菌杯中； 

（3）13000rpm，4℃，离心 30 min，弃上清，取沉淀液氮速冻后-80℃冻存备用或干冰 寄送给公司。

  3.13 眼部分泌物样本采集

送样量：扩增子 1-3 个拭子；宏基因组 3-5 个拭子 

（1）首先使用无菌生理盐水／TSB 等预先湿润无菌棉拭子（注意尽量在管壁上挤压去 掉多余液体）； 

（2）采样时（包括左眼和右眼）撑开眼睑，用无菌湿拭子蘸取分泌物，避免接触睫毛和脸缘， 必 要时可使用开睑器；

 （3）拭子头剪下放入同一支样品接收试管中，塞子塞紧密封，每个样本保存 2-3 个拭子。 

（4）采样后将样本液氮速冻后放置于-80℃冷冻保存。 

注意：由于样本特殊，微生物含量较少，建议多保管备份保存。

3.14 皮肤表面样本采集 

送样量：扩增子 3-6 个拭子；宏基因 6-10 个拭子； 

（1）将生理盐水浸湿的无菌棉签按在取样表面上，用力使其弯曲与擦拭表面成 45 度，平 稳 而缓慢地擦拭取样表面（取样面积 4 cm2，擦拭约 30 s，或根据实际情况）。 

（2）翻转棉签，让棉签的另一面也进行擦拭，但与前次擦拭移动方向垂直，取样位置应 避免与微生物取样点重复。 

（3）擦拭完成后，将每个取样点的棉签头剪下集中放入 2-5 ml 灭菌冻存管，盖子盖紧 密封， 每管保存 3-6 个拭子（宏基因组项目应增加至 6-10 个）。记录采样样品的相应 信息（样本名， 采样时间等），液氮速冻，-80 ℃保存，干冰寄送。 注意：取样过程中需佩戴口罩，每个样本取样时需更换无菌手套！ 

4 送样量要求

 4.1 扩增子项目 

土壤/污泥/沉积物/腐殖质 3 g 

水体滤膜 （孔径 0.22 μm / 直径 3-4 cm） 2 张 

拭子 3 个 

瘤胃液/发酵液/组织液 （离心有明显沉淀） 3 ml，沉淀 1 g 

粪便/肠道内容物 2 g（小鼠 5 粒） 

动物/人组织 1 g 

血浆 3 ml

鲜奶 20 ml

DNA样本 DNA 要有明显主带， 无降解， 无 RNA、 蛋白质等杂质污染 样品浓度：DNA ≥ 5 ng/μl 总量： DNA ≥ 150 ng，体积 ≥ 30 ul 

4.2 宏基因项目 

土壤 / 污泥 / 沉积物 / 腐殖质 3 g 

水体滤膜 （孔径 0.22 μm / 直径 3-4 cm） 3 张 

空气滤膜 （直径种类多， 与采样器搭配， 有明 显颜色沉淀在滤膜上） 3 张 1

拭子 5-10 个 

瘤胃液 / 发酵液 / 组织液 / 冲洗液 （离心有明显沉淀） 3-5 ml（沉淀 1 g）

粪便 / 肠道内容物 人2 g（小鼠 6-10 粒）

动物 / 人组织 1 g 

牛奶 / 酸奶 30 ml / 50 g 

食糜 2 g 

食品表面拭子 10 个 

DNA样本 样品浓度： ≥50 ng/μl 样品总量要求：≥200 ng； 纯度要求：OD260/280=1.8~2.0， 无 RNA、 蛋白 质等杂质污染 

注意： 来源于人、动物、植物组织样本做宏基因组测序，通常宿主基因组序列占比较高，实 际分析中获得的微生物数据量较低。 建议可通过以下方法避免或减轻宿主DNA对实验的干扰： 

（1） 取样时，尽量不要取靠近组织的部位，或去除肉眼可见的宿主组织； 

（2） 如果宿主有参考基因组，后续分析时可以通过比对去除宿主基因组序列。