介绍 

        本期介绍的是来自法国马赛大学的Eric Vivier教授团队在 nature immunology上发表的题为High-dimensional single-cell analysis of human natural killer cell heterogeneity的文章。

        自然杀伤细胞(NK)是一种细胞毒性先天淋巴样细胞(ILCs)，目前，它们的分类依赖于有限的表面蛋白质标记，比如根据表面标记CD16和CD56，健康人类个体主要分为细胞毒性CD56dimCD16+ NK细胞和CD56brightCD16−NK细胞。然而，对NK细胞的异质性描述目前仍未能统一和标准化。尤其是在基于NK细胞的癌症免疫治疗中，人们缺乏对其异质性的全面了解，难以避免地影响治疗的有效性或安全性。因此，在这项研究中，研究者们整合了约225,000个NK细胞(718个供体)，利用单细胞RNA测序(scRNA-seq)、单细胞转录组和表位的细胞索引测序(CITE-seq)来解剖NK细胞的异质性。

        这篇文章在健康的人血液中发现了三个不同NK细胞亚群：NK1, NK2和NK3，及其进一步分化的六个不同的亚群，最终将每个亚群的分子特征、关键转录因子、生物学功能、代谢特征和细胞因子反应作出明确描述，并展示出NK细胞的两个独立的个体起源，及其各自的转录轨迹。此外，研究者们还分析NK细胞亚群在健康个体和22种肿瘤类型中分离的淋巴细胞中的分布，建立了一项健康个体血液、肺、扁桃体和上皮内淋巴细胞以及22种肿瘤类型中NK细胞的基本分类标准。

结果

1.人类循环NK细胞的三个主要种群

        为了系统全面地对人类血液NK细胞进行分类，研究者们使用了一个高维的CITE-seq数据集，包括228个抗体衍生标签(ADTs)和来自8个健康供体的5708个NK细胞的转录谱，分析揭示了三个主要NK细胞亚群：NK1、NK2和NK3(图1a)。随后，进一步分析了它们的转录(图1b)和蛋白质组学特征(图1c,d)。

图1 | CITE-seq分析揭示了健康人外周血NK细胞的三个突出亚群

        为了进一步描述血液NK细胞的异质性，他们进一步整合了13名健康个体的36,270个NK细胞scRNA-seq数据。最终他们得到6个集群的数据集(图2a)。通过使用人类NK细胞的13个基因特征(CD160、CD244、CHST12、CST7、GNLY、IL18RAP、IL2RB、KLRC1、KLRC3、KLRD1、KLRF1、PRF1、XCL2)对数据集5中的所有CD45pos群体进行评分。然后，根据NK1、NK2和NK3已建立的转录特征评估每个簇(图2c)。其中3个簇(簇2、簇4和簇0)表现出与NK1特征的强相关性，促使它们分别被重新分类为NK1A、NK1B和NK1C。这些复杂的转录谱表明NK细胞亚群行使多种功能并存在多种调节机制，在个体之间的患病率表现出相当大的差异(图2b)。在图2e，展示了研究者们对六个聚类的前20个标记的详细转录谱分析。总之，这些分析结果为NK细胞亚群在血液中的分布和变异性提供了一定证据。

图2 | 三个最重要的NK细胞群可以细分为六个亚群

2.NK细胞亚群的分子特征

        接着，研究者们通过计算NK细胞亚群中各种相关标志物表达水平的z分数，得到一个热图，展示亚种群的更多特征(图3a)。如图所示，这些亚群对细胞因子和趋化因子具有不同程度的敏感性；其细胞毒性谱、细胞毒性分子和相关蛋白、激活标记等方面也存在明显差异。

        GO富集分析也揭示了这些NK亚群中不同的特化功能。NK1细胞主要参与细胞间粘附、激活反应、信号传导、细胞骨架活性和细胞介导的细胞毒性等过程(图3b)。这些发现表明NK1细胞具有更为关键的细胞毒性效应功能。相比之下，NK2细胞与增强的趋化调节和白细胞分化有关，这表明它们具有渗透组织和持续成熟过程的能力。NK3细胞则表现出白细胞活化的上调。图3c展示了六种主要NK细胞亚群的功能富集图。此前有研究报道，NK1B细胞对表面受体的激活反应高度敏感，这表明它们有可能成为免疫治疗策略的主要靶点。NK1A和NK1B群体均显著富集肿瘤坏死因子(TNF)和细胞因子的产生。值得注意的是，NK1C亚群似乎是最具细胞毒性的，因为其明显的细胞骨架活性和细胞杀伤特征。

        此外，研究者们发现NK1C亚群中三羧酸(TCA)循环活性存在显著富集，他们对这一现象进一步使用单细胞基因集变异分析(scGSVA)进行研究，并将NK细胞亚群基于代谢途径进行分类(图3d)。这些数据表明不同的代谢谱是NK细胞亚群的基本特征，值得进一步进行研究。

        此外，为了阐明六种NK细胞亚群对细胞因子刺激的不同反应，研究者们使用细胞因子信号分析仪(CytoSig)来预测细胞对细胞因子信号的反应。该分析表明，不同的NK群体对不同的细胞因子反应不同，这显示它们分别参与不同的细胞进程并发挥不同的功能。

图3 | NK细胞群的兴趣标记、功能和代谢特征

3. NK细胞亚群的转录轨迹

        对六种NK细胞亚群的综合研究不仅揭示了它们在标记物、细胞因子反应和功能方面的独特特征，而且还显示出它们在转录景观中的高度连续和统一，特别是在NKint和NK1A亚群之间。这种连续似乎在NKint和NK1C的转录状态之间架起了桥梁。为了研究连接这些亚群的潜在转录途径，接下来研究者们进行了多方面的分析。

        首先，通过单细胞RNA速率分析技术，他们发现，大多数NK2细胞可能会以NK2细胞的形式持续存在，形成特定的NK2轨迹(图4a,b)。而NKint到NK1C的潜在分化途径则是通过中间群体(NK1A和NK1B)过渡(图4a,b)。NK3细胞会与HCMV12的相互作用，具有独特的转录行为，因此在这里被排除分析。利用扩散图和轨迹推断，他们进一步分析证实了RNA -速率分析提出的途径(图4c-g)，也清楚地勾勒出了从NKint到NK1C的轨迹(图4d,e,g)。其中，NK2和NKint之间显示出相当大的差距(图4e)。这强化了两个不同轨迹的概念:一个是NK2细胞主要保持NK2，另一个是从NKint到NK1C。后一种轨迹与之前讨论的基于代谢的无监督聚类(图3d)一致。

图4 | 连接NK细胞亚群的推定转录轨迹

        单细胞RNA速率分析还预测了另一个主要的发育途径，表明相当一部分NK2细胞可能维持NK2细胞状态。例如，有证据表明小鼠NK细胞群来自两个不同的谱系:一个是初级祖细胞，称为早期NK细胞祖细胞(ENKP)，另一个是先天淋巴共同祖细胞(ILCP)，它也能够产生其他类型的ILCs21。通过将人类血液ENKPs的转录模块评分映射到统一流形近似和投影(UMAP)表示上，我们观察到NK1和NK3群体显示的转录特征与来自ENKPs的NK细胞的转录特征密切相关(图5a,b)。此外，基于最近可获得的血液人ILCP特征对NK1、NK2和NK3亚群进行评分22显示，它们的特征在NK2s中丰富(图5c,d)。总之，这些观察结果支持两种不同的个体形成途径的存在:一种是NK1和NK3，起源于ENKPs，另一种是NK2，起源于ILCPs。

        这种顺序分化模式突出了控制NK细胞发育和分化的复杂调节机制。在NK细胞成熟过程中起关键作用的各类转录因子，在不同NK亚群中表达趋势不同，这证实了NK细胞祖细胞存在不同谱系的假设。

图5 | 主要NK亚群的个体发育模式

4. NK细胞亚群在健康组织中的分布

        NK细胞除了存在于外周血外，还存在于组织中。循环NK细胞、组织浸润NK细胞和组织常驻ILCs之间的联系是一个新兴的研究领域。ILC的变化很大程度上取决于它们所处的环境和局部信号(如细胞因子)，从而导致不同组织和疾病中不同的ILC谱。因此，研究者们分析了早期研究中的scRNA-seq数据，以研究从健康个体分离的扁桃体、肺和上皮内淋巴细胞(IELs)中NK1、NK2和NK3亚群的分布(图6a)。

        他们发现，NK1和NK2的特征分别与肺、扁桃体和IELs中鉴定的CD56dim和CD56bright亚群相吻合(图6b)。IEL ILC1和NK3子集之间显示出很大的相似性(图6a,b)。这些结果表明，应该重新分析IEL ILC1s与NK细胞之间的相似性以及IEL ILC1s与其他组织驻留ILC1s的差异。

图6 | NK1、NK2和NK3细胞亚群在组织中的分布

5. NK细胞亚群在肿瘤中的分布

        由于研究者们希望该项分析能为将来与疾病状况的比较提供一个基准。因此，他们分析了NK1、NK2和NK3细胞亚群在22种癌症类型中的分布模式(图7)。利用经典的标签转移法，他们研究了这些亚组在组织和癌症类型中的比例和转录接近性。结果发现NK细胞亚群分布因肿瘤类型而异(图7a)。这种分布与血液中发现的不相关(图7a)。主成分分析(PCA)证实了循环NK细胞和肿瘤相关NK细胞之间的这种差异(图7b, PC1)和瘤床上NK1, NK2和NK3注释的准确性(图8a,b, PC2和PC3)。

图7 | NK1、NK2和NK3细胞亚群在癌症患者血液和肿瘤床上的分布

        在癌症患者的血液中也证实了NK2和其他亚群之间的差异，但肿瘤对NK1、NK2和NK3亚群之间差异的影响在瘤床上比在血液中更强(图8a,b)。NK1s、NK2s和NK3s在瘤床中的分组优于血液中的分组，这也表明肿瘤中它们的表型更为明显。

图8 | 癌症患者血液和瘤床中NK1、NK2和NK3细胞亚群的不同转录表型

讨论

         总的来说，这篇文章所描绘的NK细胞图谱不仅可以为今后健康和疾病时血液中NK细胞的研究提供参考，也是了解组织中NK细胞多样性与循环NK细胞的关系、组织中NK细胞的个体发生以及健康和疾病时组织中NK细胞与ILC1s的关系的有利工具。