今天分享一篇 2026 年 8 月在线发表于神经病理顶刊《Acta Neuropathologica Communications》的文章，DOI：10.1186/s40478-026-02394-9，文章主要聚焦创伤性脑损伤（TBI）后血脑屏障（BBB）损伤的空间分子机制，创新性整合空间转录组学与双示踪剂示踪技术，锁定内皮 EphA4 是调控 BBB 完整性的关键负向调控因子，下游 Wnt/β-catenin 通路是极具潜力的 TBI 治疗靶点。

创伤性脑损伤（TBI）是造成神经功能缺损的首要诱因，除原发撞击损伤外，氧化应激、神经炎症、血脑屏障（BBB）破坏构成的继发性损伤级联反应，会持续加重脑组织损伤，诱发长期认知衰退。 

BBB 完整性失衡是 TBI 核心病理特征，但传统研究存在两大短板：

既往研究提示 EphA4 受体参与中枢损伤应答，但血管内皮特异性 EphA4如何调控损伤后 BBB 功能、下游分子通路完全未知。

本文研究者们通过构建内皮特异性 EphA4 敲除小鼠（EphA4^f/f  VE-Cadherin-CreERT2，KO），联合小分子荧光素钠（NaFl，<1 kDa）、伊文思蓝（EBD，~67 kDa）、内源 IgG（150 kDa）三重示踪体系，搭配 Visium 空间转录组，解析 TBI 后 BBB 时空损伤规律与 EphA4-Wnt 调控轴。

野生对照组（WT）：EphA4^f/f

内皮特异性敲除组（KO）：EphA4^f/f VE-Cadherin-CreERT2，他莫昔芬腹腔注射 5 天诱导内皮 EphA4 敲除，间隔 2 周后实施控制性皮层撞击损伤（CCI，经典 TBI 造模手段）；

实验动物：8–10 周雄性 CD1 小鼠，排除雌激素对血管、免疫的干扰。

静脉联合注射两种外源性示踪剂：

10x Visium 空间转录组解析损伤皮层原位基因表达； 通路验证药物：

FZM1：FZD4 拮抗剂，抑制 Wnt 通路；

FZM1.8：FZD4 选择性激动剂，特异性激活内皮 Wnt/β-catenin。

研究人员对 WT 小鼠分别在损伤后 1、4、7、14 天收取脑组织，通过 NaFl、EBD、IgG 三重标记量化不同分子量物质的血管外渗体积，完整还原 BBB 从破损到修复的全过程：

1.损伤后 1 天（1dpi，损伤急性期峰值）：

同侧损伤皮层中 IgG、EBD、NaFl 三种示踪剂均出现大面积、高体积外渗，共聚焦图像可见损伤核心区荧光信号完全弥散，代表 BBB 细胞旁通道、跨胞转运通路全面开放，大、中、小分子物质均可自由穿透血管壁；对侧正常皮层几乎无任何示踪剂渗漏，作为阴性对照基线。

2.损伤后 4 天（4dpi，亚损伤早期）：

3.损伤后 7 天（7dpi，亚损伤晚期）：

EBD 完全无法穿透血管，损伤皮层无紫红色荧光，代表大分子屏障基本修复；IgG 仍能检测到微弱红色信号，但并非新鲜渗漏，而是损伤早期漏出的 IgG 蛋白长期滞留于损伤脑组织基质中；NaFl 小分子渗漏依旧显著，是 7 天内唯一持续存在的通透性缺陷。

4.损伤后 14 天（14dpi）

该组结果直接推翻仅依靠伊文思蓝评估 BBB 的传统实验逻辑：

仅检测 EBD 会误判 7dpi 时 BBB 已完全修复，忽略小分子持续渗漏带来的长期神经炎症、神经元损伤风险，证明多分子量梯度示踪体系是精准评估 TBI 后血管损伤的必备手段。

Figure 1

图1. 内皮特异性敲除 EphA4 小鼠构建策略

研究同步量化同侧损伤皮层、海马两大关键脑区的示踪渗漏，分时间点对比 WT 与 KO 小鼠的通透性差异，且通过空间转录组成像验证内皮 EphA4 敲除模型构建成功：

空间转录组 EphA4 表达热图显示：WT 小鼠损伤半球皮层、海马、丘脑血管富集区域均有高强度 EphA4 转录信号；KO 小鼠全脑 EphA4 转录丰度显著下调，血管区域几乎无阳性信号，证实他莫昔芬诱导的内皮特异性敲除效率达标，可用于后续功能实验。

1）急性期 1dpi：KO 小鼠 EBD、IgG 外渗体积显著低于 WT，小分子 NaFl 两组无统计学差异。说明内皮 EphA4 缺失可快速抑制急性期大分子血管破裂、重度渗漏，但无法立刻阻断小分子瞬时通透；

 2）亚急性期 4dpi：KO 组 NaFl、EBD、IgG 三类示踪剂渗漏全部显著低于 WT，大、小分子屏障同步改善； 3）亚急性期 7dpi：WT 小鼠 NaFl 依旧大量外渗，而 KO 小鼠 NaFl 渗漏量大幅下降，证明 EphA4 敲除能显著加速小分子屏障修复，缩短持续性渗漏窗口。

BBB 渗漏不局限于撞击原发皮层病灶，会扩散至毗邻海马组织，而海马损伤直接关联 TBI 后长期认知衰退：

 1dpi、4dpi 时 KO 小鼠海马 NaFl 小分子渗漏显著低于 WT；7dpi 两组海马 NaFl 渗漏无差异。

提示内皮 EphA4 缺失能在损伤早期保护海马微血管，减少小分子持续渗漏诱发的海马神经炎症、突触损伤，为改善远期认知功能提供结构基础；

海马区 EBD、IgG 渗漏在 WT 与 KO 之间无显著差异，说明 EphA4 对海马血管的保护作用特异性针对小分子通透通路。

研究将损伤脑组织手动划分 4 类功能感兴趣区（ROI）：

EBD 阳性重度损伤区、NaFl 阳性轻度渗漏区、同侧无渗漏皮层、对侧健康皮层，结合 UMAP 聚类、差异基因（DEG）、GO 富集、特征基因热图多维度解析分子变化：

Figure 2

图 2. WT/KO 损伤皮层空间转录组全局分析，差异基因火山图、DEG 数量韦恩图、Wnt 通路富集弦图、BBB 关键基因热图、Srf 空间表达特征图

1. UMAP 聚类证实渗漏分区存在完全独立的转录程序

所有空间测序斑点依据所属 ROI 自动分群，EBD 区、NaFl 区、同侧正常皮层、对侧健康皮层聚类边界清晰，证明不同 BBB 损伤程度的脑组织拥有完全异质性的基因表达特征，普通混合组织测序会掩盖区域特异性分子变化。

2. KO 小鼠损伤皮层紧密连接、血管稳定相关基因整体性上调

对比 WT 与 KO 同侧损伤皮层的差异基因，KO 组内皮屏障功能核心转录本显著升高：

Figure 3

图 3. 基于示踪渗漏划分脑组织损伤感兴趣区（ROI）；分区转录组 UMAP 分群、上下调基因韦恩图、不同损伤区域 GO 富集气泡图、分区关键差异基因热图

3. 神经保护基因上调，氧化损伤、星形胶质过度活化基因下调

研究发现，保护性转录因子 Npas4、Nr4a1 在 KO 皮层显著升高，二者可抑制神经元凋亡、调控应激适应、减轻小胶质细胞过度炎症激活；

金属硫蛋白 Mt1、Mt2、Mt3 表达显著降低，该家族蛋白会抑制 Wnt 通路 β-catenin 核转运，Mt 下调直接解除对 Wnt 信号的抑制；

重度损伤 EBD 区星形胶质活化标志物 Vim、Gfap 在 KO 组织表达下降，提示内皮 EphA4 缺失可缓解损伤诱导的反应性星形胶质增生，减少胶质瘢痕形成。

4. 不同渗漏分区具备独特分子损伤特征，EphA4 缺失同步修复两类损伤微环境

Figure 4

图 4. WT/KO 的 EBD 阳性损伤区、NaFl 渗漏区相较于正常皮层的差异基因与 GO 富集环形图；KO 与 WT 分区分子通路直接对比

研究发现，EBD 阳性重度损伤核心区存在WT 样本高表达血红蛋白、出血相关基因（Hbb-bs、Hba-a2），突触传递、神经元可塑性基因（Snap25、Camk2a、Sparcl1）显著下调，这代表出血、神经元功能重度受损；

KO 该区域突触相关基因表达回升，血管损伤相关转录本降低；NaFl 阳性轻度渗漏周边区，WT 样本富集炎症、应激基因 Gfap、Fos、Ptx3，神经元记忆相关 Calb1 下调；

KO 该区域 Npas4、Nr4a1 等适应性应激基因显著上调，促炎通路 Serpina3n、Slc38a1 表达下降，炎症微环境得到缓解；

 GO 富集分析证实，EBD 区核心通路集中于血管破裂、组织重塑、神经元凋亡；NaFl 区通路富集于突触组装、膜电位调控、慢性炎症；内皮 EphA4 敲除可同时改善两种区域的有害转录程序，促进神经血管单元修复。

5. Wnt 信号通路是 KO 小鼠最显著富集的上调通路

KO 损伤皮层大量 Wnt 通路配体（Wnt7a、Wnt9a、Wnt10b）、膜受体（Fzd1、Fzd4）、共受体 Lrp1 表达显著高于 WT；

免疫荧光共染 CD31（内皮标志物）与 FZD4 证实：FZD4 蛋白特异性定位在脑微血管内皮细胞，确定内皮细胞 Wnt 通路是 EphA4 缺失的下游核心效应轴。

研究采用 “通路抑制 + 通路激活” 正反两套药物实验，直接因果验证 Wnt 通路的功能作用，同时检测血管 β-catenin（Wnt 通路活性标志物）表达水平：

Figure 5

图 5. EC特异性EphA4敲除内皮细胞中Wnt信号通路的调控影响CCI损伤后的血脑屏障完整性及病灶体积

首先是通过FZD4 拮抗剂 FZM1 处理 KO 小鼠，完全逆转血管保护效应。

研究者们在CCI 造模后 1dpi（损伤峰值时间点）对 KO 小鼠尾静脉注射 FZM1（FZD4 别构抑制剂，阻断内皮 Wnt 信号），设置溶剂对照组：

Figure 6

图6. CCI损伤后，Frizzled 4（FZD4）受体抑制剂Fzm1可减轻血管β-连环蛋白的表达

随后研究者们通过FZD4 选择性激动剂 FZM1.8 处理 WT 小鼠，独立模拟血管保护效果。

他们对普通 WT 创伤小鼠给予 FZM1.8（内皮特异性 FZD4 激动剂，激活 Wnt 通路），溶剂为对照：

该实验直接证明：

仅激活内皮 FZD4/Wnt 通路，无需敲除 EphA4，即可独立实现稳定 BBB、减轻 TBI 继发性损伤的治疗效果，为临床靶向药物开发提供直接依据。

Figure 7

图7. 使用Frizzled 4（FZD4）受体激动剂激活Wnt信号通路，可保护血脑屏障的完整性，并减少病灶体积

1.  药物仅在损伤急性期给药，未探究亚急性、慢性期给药的长期修复效果；

2.  Visium 单捕获斑点包含多种细胞，无法将转录变化精准归因于内皮、周细胞、星形胶质单一细胞；

3.  仅用雄性小鼠实验，未验证性别差异；

4.  示踪渗漏仅反映通透性，未电镜验证紧密连接超微结构改变。