灵思研发团队组学相关—微生物多样性测序16S rRNA 下面就让我们一起来学习组学相关的系列产品，上一期转录组，接下来我们继续微生物多样性测序16S rRNA，熟悉了解灵思生物，走进灵思，感受不一样的生物知识......
武汉灵思生物
武汉灵思生物技术有限公司（Wuhan Lingsi Biotech Co.,Ltd.）成立于2015年11月，是一家专注于生命科学和生物技术领域的高科技企业。公司主要以细胞及实验动物为主要研究对象，利用常规分子生物学、细胞生物学及免疫学等技术联合高通量组学（基因组、蛋白组及代谢组）分析手段，推动疾病发病机制及药物疗效、药物作用靶点筛选及作用机制探讨。公司本着“设计合理、理念新颖、研发严谨、数据准确”的研究理念和不断创新、开拓进取的创业精神、通过高度细分、全方位的服务平台；帮助广大科研工作者在各研究领域突破贡献绵力，为生命科学的可持续发展提供强有力的帮助。
几个世纪以来，通过形态学将生物分类成不同的类群和物种。尽管这足以让达尔文和早期生物学家研究某些生物的进化和亲缘关系，但当特性不同时，这种方法就变得困难。
遗传差异可以通过观察核糖体RNA ( rRNA )的某些序列来研究，因为这些序列在相同属和物种的生物体中是保守的，但与其他物种相比有所不同。16S rRNA是常用于区分细菌种类的rRNA序列。
16S rRNA测序是20世纪70年代首次用于系统发育研究。随后的研究有助于巩固生命树的“三域”观点，其中真核生物、细菌和古细菌是不同的域，而不是以前持有的真核生物和原核生物的分裂。从那以后，它还通过重新分类和重新命名一些物种，以及通过鉴定不可培养和未知的细菌，帮助澄清细菌之间的关系。
1、技术简介
菌群多样性组成谱测序以细菌或者古菌 的16S rRNA 基因可变区、真菌 18S rRNA 基因可变区或真菌 ITS（Internaltranscribed spacer）内转录间隔区等微生物特征序列（Signature sequence）或者某些特定功能的基因位点（功能基因或扩增子）为靶位点，通过检测序列的变异和数量，反映菌群中各类微生物物种的身份和丰度，从而快速了解菌群物种分布特征，阐明样本间多样性和组成差异，进而发现差异相关物种。（16S rRNA是原核生物的核糖体中30S亚基的组成部分，长度约为1542nt，具有高度的保守性和特异性。16S rRNA基因是细菌上编码rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌的基因组中。包含保守区和可变区，保守区反映了物种间的亲缘关系，可变区反映了物种间的差异。16S rRNA基因测序一般是利用MiSeq对16S rRNA基因的V3-V4可变区进行测序，以此来研究微生物的多样性。）
丰度：是指一种化学元素在某个自然体中的重量占这个自然体总重量的相对份额（如百分数）。丰度表示方法主要分为重量丰度、原子丰度和相对丰度。
2.技术路线
2.1样品准备
| 样本类型 | 土壤/污泥 | 粪便 | 血液 |
| 样本要求 | 1-5g | 1-5g | ≥2ml |
动物类样品
1. 粪便：
用灭菌的2.0mL离心管保存，单个样本取样量：0.5-1.0g/管，如不能及时送样，请-80摄氏度冰箱冷冻保存。为保证实验顺利进行，每个样本取3-5管备份，寄送样本时选择干冰或足量冷冻冰袋运输，寄送到公司时，样品仍处在冷冻状态。
注：如粪便样品量较多或不能马上收集，最迟要在 2 小时之内全部收集完。
2. 肠道内容物：
用无菌手术刀刮取或镊子挤出内容物，用灭菌的 2.0mL 离心管保存，单个样本取样量：0.5-1.0g/管，如不能及时送样，请-80 摄氏度冰箱冷冻保存。为保证实验顺利进行，每个样本取 3-5 管备份，寄送样本时选择干冰或足量冷冻冰袋运输，寄送到公司时，样品仍处在冷冻状态。
3.肠道组织：
新鲜的组织样本用无菌磷酸盐缓冲液 (1*PBS ，PH=7.2) 轻轻清洗，直到没有内容物流出；用无菌的显微镜玻片刮取附着在表面的组织微生物，用灭菌的 2.0mL 螺口EP管保存，液氮速冻 15min 以上，如不能及时送样，请-80摄氏度冰箱冷冻保存。为保证实验顺利进行，每个样本取 3-5 管备份，寄送样本时选择干冰或足量冷冻冰袋运输，寄送到公司时，样品仍处在冷冻状态。
4. 生殖道样本：
消毒外阴或尿道口，无菌棉签拭子拭取宫颈口或宫颈后穹窿的分泌物，不可碰及阴 道壁，圆周滚动 5 次，充分取样，用无菌剪刀剪下棉签头部，放入装有 Amies 培养基的无菌离心管中，如不能及时送样，请-80 摄氏度冰箱冷冻保存。为保证实验顺利进行，每个样本取 3-5 管备份，寄送样本时选择干冰或足量冷冻冰袋运输，寄送到公司时样品仍处在冷冻状态。
5. 唾液样本：
用灭菌的 2.0ml 离心管，每管收集 1~2ml，-80 摄氏度冰箱冷冻保存。为保证实验顺 利进行，每个样本取 3-5 管备份，寄送样本时选择干冰或足量冷冻冰袋运输，寄送到公 司时样品仍处在冷冻状态。
环境类样品
1. 土壤样本：
用灭菌的 2.0ml 离心管或小自封袋，每份 0.5~2g，如不能及时送样，请-80 摄氏度 冰箱冷冻保存。为保证实验顺利进行，每个样本取 3-5 管备份，寄送样本时选择干冰或 足量冷冻冰袋运输，寄送到公司时，样品仍处在冷冻状态。
注：土壤类样品，应避免送样过多，造成保存空间紧张。
2. 水体样本（含污水、尿液等液体样本）：
水样需要通过相应孔径的滤膜进行过滤，过滤后微生物会截留在滤膜上，将滤膜置于离心管中，如不能及时送样，请-80 摄氏度冰箱冷冻保存。由于材质问题，冷冻后的滤膜较脆易碎，建议冷冻时间不要太久，尽快送样。为保证实验顺利进行，每个样本取 3-5 管备份，寄送样本时选择干冰或足量冷冻冰袋运输，寄送到公司时，样品仍处在冷冻状态。
注：微孔滤膜建议使用 0.45μm 和0.22μm 孔径，0.45μm 富集真菌类或者直径更大的微生物；0.22μm 富集细菌类或者直径更大的生物，可根据科研需要选择合适孔径的滤膜。
食品类样品
1. 固体类：
总量>20g，用灭菌的 2.0ml 离心管分装，如不能及时送样，请-80 摄氏度冰箱冷冻 保存。为保证实验顺利进行，每个样本取 3-5 管备份，寄送样本时选择干冰或足量冷冻 冰袋运输，寄送到公司时，样品仍处在冷冻状态。
2.液体类：
液态类建议进行过膜处理后按照水体送样进行，无条件时可进行原样送样，总体积 30-50ml，用 50ml 离心管分装， 4 度冷藏保存，足量冷冻冰袋运输，寄送到公司时，冰 袋仍处在冷冻状态。
注意：
1. 为避免送样量不足，导致的提取总量不足问题，我们希望合作方送样量不低于最少送样量， 最好达到推荐送样量的标准，以避免需要反复提取而样本不足的情况，因此导致反复送样而出现周期延误的状况。
2. 液态类的样品，必须用冰袋寄送，超出送样标准规定范围之外的送样方式，可事先沟通解决！
2.2实验流程
样本中微生物组总DNA提取（质量检测）→目标片段PCR扩增（纯化回收）→扩增产物检测定量→测序文库制备→上机进行高通量测序→生信分析（常用的生物信息分析软件主要是QILME，包括OTU聚类及多样性等多种分析，还有详细的文档说明。）
2.3生信分析流程
3.主要结果展示（部分标准分析内容）
标准分析 | 解决问题 |
| 物种注释 | 进行物种注释及各物种丰度信息 |
| α-多样性分析 | 微生物群落的丰富度和多样性 |
| β-多样性分析 | 不同样本（组）间的微生物群落及各样本（组）差异情况 |
| 多元统计分析 | 寻找组间具有显著差异的物种，同时可以比较组内差异和组间差异的大小，判断分组是否有意义 |
| 功能预测 | 预测样本的功能组成 |
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