稳定表达细胞株构建方法

2023-05-24

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导读

这一讲，主要的目的是详细讲解一下利用慢病毒来构建稳定表达细胞株的主要流程，讨论稳定株筛选过程中的关键点。让初学者在完成慢病毒包装后能够快速的进行稳定表达细胞株的筛选与鉴定。

如果对慢病毒包装还有疑问，请参考：慢病毒包装详细教程。

稳定细胞株构建的主要流程及关键点分析：

1.最佳感染复数MOI的确定

众所周知VSVG包膜蛋白能够感染多数细胞，但是对于不同种属、不同组织来源的细胞，慢病毒的感染性是有很大差别的。像一些神经细胞、淋巴细胞、树突状细胞等，慢病毒感染效率低。

MOI（multiplicity of infectin），感染复数，含义为感染时病毒和细胞数量的比值。比如细胞接种量为1×10⁴/孔，MOI为10，慢病毒的滴度为1×108TU/ml，那么每孔加入慢病毒的量为1µl。

那如何确定病毒感染目的细胞的MOI呢？多数细胞查阅文献也能获得推荐的MOI，但不同实验室，不同病毒测算出的MOI也有差别。所以建议根据自己包装的慢病毒重新检测MOI。简要步骤如下：

（1）目的细胞正常传代，接种96孔板，按细胞的生长速度来确定接种量，一般情况以72h长满单层为标准；

（2）根据测定的慢病毒滴度，进行病毒的稀释；

（3）MOI设定1、5、10、20；

（4）96孔板中的细胞过夜培养后，换液加病毒，同时加入终浓度为8µg/ml polybrene；

（5）3天后观察荧光比例；

（6）以80%细胞发荧光来评价最佳MOI。

注意：

（1）细胞接种的密度，太稀有可能细胞会死亡，太密不利于后面的荧光观察。96孔板大部分细胞可以接种1-5×10³/孔，具体接种量要根据不同细胞的生长速度来确定；

（2）Polybrene的浓度也需要根据不同的细胞去调整，有些细胞比较敏感，可以不加；

（3）对于MOI的分组设置也需要根据不同细胞去调整，大部分癌细胞可以根据上面的比例去设置，但有些难感染的细胞可能需要增加到100个MOI。

2.慢病毒感染目的细胞

通过上述实验确定了慢病毒感染目的细胞的最佳MOI，接下来就可以进行稳定细胞株的筛选工作了。

将目的细胞接种24孔板，控制好细胞密度，贴壁后大约为30%-40%左右的密度；

细胞过夜培养后，按最佳MOI加入病毒，同时加入终浓度为8µg/ml polybrene。

注意：

（1）目的细胞的接种密度，以接种病毒后48h长成单层为标准；

（2）Polybrene的浓度根据不同细胞去调整；

（3）用24孔板来进行实验，主要是为了节约病毒的使用量。也可以直接拿上一步96孔板中的细胞进行后续实验；

（4）对于极难感染的细胞，比如淋巴细胞之类的，需要进行特殊方法感染，后期会有相应专题来讲解。

3.加压筛选

（1）细胞感染病毒48h 后，荧光显微镜下观察荧光细胞比例；

（2）对24孔板细胞进行传代，根据细胞生长速度由一个孔分成3-5个孔，过夜培养。同时也接种正常的未感染病毒的目的细胞；

（3）根据包装的慢病毒载体上的筛选抗生素，进行加压筛选，这里以嘌呤霉素为例；

（4）不同细胞对嘌呤霉素的敏感程度也不一样，所以需要设浓度梯度。本实验室的经验是从1µg/ml到10µg/ml去设立3-5个浓度梯度；

（5）再培养24-48h后观察细胞的死亡情况，选择最佳的嘌呤霉素浓度孔细胞进行后续实验；

（6）后期根据细胞的生长速度和生长情况，可以适当增大或减少嘌呤霉素的浓度；

（7）待细胞长满后进行扩大培养，用于检测目的基因的过表达或者干扰情况；

（8）检测正确后进行细胞的培养冻存或者继续进行单克隆细胞株的筛选。

注意：

（1）嘌呤霉素最佳浓度的确定：首先是正常细胞必须全部死亡，其次就是根据各孔细胞死亡情况来确定，一般选择死亡超过50%，细胞生长速度较其它孔不会明显降低。因为细胞死亡少的话可能会有很多低表达量的细胞存在，如果细胞死亡过多，也会导致细胞扩增很慢，不利于快速获得稳定细胞株；

（2）嘌呤霉素的浓度设置，可以去参考文献，根据文献推荐的浓度来进行梯度设置，如果没有文献支持，可以多设置梯度去筛选；

（3）选择了最佳的嘌呤霉素浓度，不代表后面一直用这个浓度，要根据细胞的生长情况来判断，适时的去增减嘌呤霉素的浓度；

（4）细胞长满后尽快扩大培养去检测目的基因的表达情况，检测方法一般是qPCR和WB；

（5）可以根据实验目的选择是否要进行单克隆细胞株的筛选。

4.单克隆细胞株的筛选

如何获得高表达或者高干扰效率的单克隆细胞株，是很多科研工作者比较头疼的事情，往往单克隆细胞株的过表达或干扰效率比混合克隆差。

在这里，作者想说混合克隆和单克隆各有优缺点。混合克隆制备周期短，过表达和干扰效果往往也很好，但随着传代次数的增加，过表达和干扰效果可能会下降；单克隆细胞株传代方面会比混合克隆好，但其制备周期长，检测成本也翻很多倍。因为如果想要获得一株高表达或者高干扰的稳定株，需要筛选很多单克隆细胞去进行检测，工作量会增大很多倍。

所以如果想获得效果好的单克隆细胞株，建议是增加筛选的总量。很多研究者正是因为筛选总量不够，或者的单克隆细胞株数量有限，也就导致了很难筛到效果好的细胞株。

常规的筛选单克隆细胞株有两种方法，原理是一样的，操作上有些区别。

（1）有限稀释法：将鉴定正确的混合克隆细胞株进行传达计数，然后将细胞稀释到每10ml 50个细胞。再将细胞悬液接种96孔板，一般情况建议接种4块，便于后续筛选到效果好的单克隆细胞株；

（2）第二种方法原理一样，操作是：A1孔接种1000个细胞，纵向往下倍比稀释，然后所有的第一列细胞再横向倍比稀释。同样建议接种4块96孔板。

两种方法都需要培养数天，并且需要不断观察，找出只有单个细胞增殖的，且100%发荧光的细胞孔。做好标记，定期换液（含有嘌呤霉素）。

待细胞长满后进行检测，筛选出高表达或高干扰效率的细胞株，然后进行扩大培养冻存或者进行后续实验。

注意：

（1）由于第一种方法细胞接种量少，所以可以选择一个孔多加些细胞，这样观察时方便用这个孔来进行聚焦；

（2）接种96孔板时，可以不用加嘌呤霉素，待细胞生长稳定后再换液，补加嘌呤霉素；

（3）增大筛选的总量，是为了能获得最佳效果的单克隆稳定细胞株。

5.案例图片展示