背景：益母草为唇形科植物益母草的新鲜或干燥地上部分，性微寒,味苦、辛。归心包、肝、膀胱经，在《神农本草经》中列为上品。常当作妇科用药，在亚洲和欧洲多地拥有超过两千年的药用历史；具有活血调经、利尿消肿、清热解毒之效。

目前从益母草中共分离并鉴定出约 800多种化学成分，主要包括生物碱类、类黄酮和二萜、脂肪酸类等。有特殊气味的萜类化合物常常是唇形科药用植物的主要活性物质，但在益母草属中，活性物质却以益母草碱为代表的生物碱为主；其含量占植物鲜重的 0.02% - 0.12%。

益母草碱，是一种活性酚类生物碱，只在益母草属植物中发现。它最初发现于1930年，后续研究报道益母草碱可以调节许多生理过程；可在多种临床疾病中发挥作用，如心血管疾病、中枢神经系统、糖尿病、妇产疾病等。

推荐文章：Multi-Omics Analyses of Two Leonurus Species Illuminate Leonurine Biosynthesis and Its Evolution.  Doi: 10.1016/j.molp.2023.11.003.

虽然益母草碱具有重要的医疗及应用前景，但是，益母草碱在植物体内的生物合成途径未见报道。氨基酸是植物许多次生代谢物的合成前体，根据益母草碱的结构推测其合成主要来源于前体物质：丁香酸和精氨酸。但在生物体内由丁香酸和精氨酸为底物反应产生益母草碱未见报道。

研究方法：

1. 针对益母草和细叶益母草两种植物亲缘关系密切、形态相似，但一个能产生大量益母草碱，另一个却几乎不含益母草碱。使得它们成为了益母草碱合成极好的研究对象。

图A：自然生长的益母草及细叶益母草生长形态和染色体组型；

图B：益母草及细叶益母草代谢组学分析差异比较。

经过广靶代谢组分析，在益母草中共鉴定出858种代谢物，细叶益母草鉴定出888种代谢物，益母草的黄酮类，酚酸，生物碱、氨基酸衍生物，木质素及香豆素，脂质等的丰度略高于细叶益母草，而细叶益母草的萜类，有机酸多样性略高于益母草。

2. 在对目标化合物益母草碱的LC-MS分析中发现，在植物生长期，益母草叶中存在大量益母草碱，根中只有微量积累，而细叶益母草根和叶中几乎没有益母草碱。

图C：益母草及细叶益母草叶和根中益母草碱总离子流分析；

图D：益母草中益母草碱与标准样品质谱数据对比；

图E：两种益母草不同组织（叶和根）中益母草碱定量分析。

3. 通过植物全基因组的测序组装，有助于开展植物的遗传育种及进化研究。由于益母草属植物暂无植物基因组公布，通过三代ONT结合二代 Illumina 测序数据及 Hi-C 辅助组装得到染色体水平基因组。最终益母草基因组组装大小为518.19 Mb，细叶益母草基因组大小为472.29Mb；两个基因组的二代比对率都大于99.5%，表明两个基因组组装连续性较好。由于染色体的断裂和重排，导致益母草比细叶益母草多一对染色体。结构上尽管有差异，但大部分染色体区域有良好共线性；基因家族分析表明，两个物种基因高重复保守，共享大约86%基因家族。

图A：益母草与细叶益母草基因组组装注释图。

图B：两种益母草染色体共线性分析；

图C：益母草与细叶益母草基因家族分析。

4. 根据前体物质丁香酸和精氨酸结构分析，推测益母草碱的生物合成途径是由两类酰基转移酶催化形成：BAHD 酰基转移酶（辅酶A作为底物）和丝氨酸羧肽酶样酰基转移酶（SCPL，形成葡萄糖酯）。精氨酸则由脱羧酶，胺氧化酶，醛还原酶作用生成4-胍基丁醇，经酯化可得目标产物益母草碱。

通过构建4CL 基因系统发育树对筛选到的 4CL 的功能进行了验证，发现所选的 4CL均不能以丁香酸为底物产生丁香酰辅酶A；由此判断益母草碱可能是经 UGT糖基化后最后由 SCPL 催化形成。将SCPL及UGT基因进行定位作图，发现SCPL 串联重复基因仅分布于益母草2 号、4号、5 号和 7 号染色体，并且与 UGT 串联重复序列距离较近；但该结果还需要后续转录组及代谢组印证。

5. 转录组-代谢组关联分析：通过广靶代谢组共检测到18种益母草碱合成通路中间代谢物，其中13 种代谢物含量在益母草和细叶益母草之间具有差异显著性。除咖啡酸、阿魏酸、芥子酸之外，其余 10 种在益母草中含量更为丰富。当皮尔逊相关系数大于 0.90，且 p 值小于 0.05 时，与益母草碱含量差异正相关的通路基因共22 个。

图A：益母草与细叶益母草通过LC-MS进行代谢组学水平检测；

图B：两种益母草与益母草碱基因转录水平关联分析。

6. 基因功能验证：ADC催化益母草碱合成反应第一步，LjADCs 和 LsADCs基因序列高度相似；通过测定基因的表达量，表明ADC2 在两种益母草中均有表达，ADC1 仅在益母草中表达，在细叶益母草中几乎不表达。尽管 LsADC2 在植物中表达量较高（LjADC2也有一定程度表达），但酵母体内酶活检测二者催化精氨酸生成 4-胍基丁胺的活性非常微弱；相反LjADC1具有较高的精氨酸脱羧酶活性。这可能是限制植物产生益母草碱的重要因素。

图A：4-胍基丁醇的生物合成途径；

图B：ADC蛋白的系统发育分析；

图C：ADC 酵母体内酶活检测；

图D：qRT-PCR 检测益母草与细叶益母草 ADC1 和 ADC2 表达水平。

7. 中间体含量分析： 在细叶益母草中检测不到前体物4-胍基丁醇及益母草碱，但通过对叶片饲喂4-胍基丁醛和4-胍基丁醇，就可以检测到4-胍基丁醇及益母草碱含量。这表明在细叶益母草中氧化酶（AO）及还原酶（GLYR）均有表达。

图J-K：益母草及饲喂4-胍基丁醛和4-胍基丁醇后细叶益母草中间体及终产物含量。

8. 糖基转移酶的筛选：通过酶活测定将进化分析得到的几个糖基转移酶验证其功能，筛选催化活性最高的糖基转移酶。

实验表明，LjUGT5及LsUGT5糖基转移酶具有较好的催化功能。

9. LjUGT5及LsUGT5糖基转移酶在植物不同器官的表达水平：通过对益母草及细叶益母草植物不同器官（根，茎，叶，花）的表达水平分析，显示益母草中LjUGT5糖基转移酶表达水平最高。

图D：不同糖基转移酶催化所得糖基化产物含量；

图E：LjUGT5在益母草不同器官表达水平；

图F：LsUGT5在细叶益母草不同器官表达水平。

10. SCPL的进化树分析及生产益母草碱的最佳酶学筛选：通过糖基转移酶筛选得到最佳糖基转移酶为LjUGT5，经SCPL催化酯化反应所得益母草碱。

实验表明，由细叶益母草糖基转移酶LjUGT5及酯化酶LjSCPL12共同催化所得益母草碱含量最高。

图A：进化树分析得到的五种唇形科植物候选SCPL酯化酶；

图B：在酵母中SCPL酯化酶催化益母草碱的生物合成功能验证。

11. LjSCPL10及LjSCPL12的表达水平分析：LjSCPL12在益母草中表达水平更高，催化活性更好。

图C：催化益母草碱生物合成的LjSCPL10, LjSCPL12和LjSCPL13活性比较；

图D：LjSCPL10, LjSCPL12在植物不同器官中的表达水平。

12. 唇形科植物益母草碱的生物合成基因簇进化分析：在益母草碱的生物合成途径中存在一个由UGT和SCPL基因组成的基因簇，该基因簇在唇形目植物芝麻、丹参、黄芩和益母草中均存在。UGT和SCPL的基因扩增以及SCPL的新功能化共同决定了益母草碱在益母草中的特异合成和积累。

图C：SCPL 和 UGT 串联重复基因共线性结果。

该研究组装了益母草和细叶益母草的高质量基因组，利用多组学生化实验，从头构建了益母草碱的生物合成途径。明确了导致两种益母草中益母草碱含量差别因素，揭示了益母草碱在植物体中的合成途径。