如何做好ELISA实验？

一、ELISA试剂盒的选择：

1、根据样本类型的考虑

包含细胞上清、血清和血浆样本及匀浆液样本（如尿、脑脊液等各种体液）。

（1）细胞上清：

培养细胞过程中，一般是10%的牛血清加入培养基中，经过培养后，细胞的吸收消耗，最后细胞上清中蛋白含量会很少。

（2）血清：

是最常用的ELISA标本之一，ELISA检测中血浆一般可视为与血清同等的标本，标本中干扰性物质是引起检测后结果偏高或偏低的主要原因。

（3）组织匀浆样本：

研磨样本时需要注意样本质量与所加的研磨液一定要成比例。

2、根据检测范围的选择

在选择ELISA试剂盒时，应先初步了解待测目标物在自己样本类型中的浓度大概范围。再根据范围进行选择试剂盒。

（1）待测标本类型是哪种，可先通过文献资料查阅了解在该种标本类型中待测物的范围；

（2）可通过文献资料查阅病理水平的浓度范围，可作为最后判定是否需要稀释的依据；

（3）选购的ELISA试剂盒的最小浓度值是多少，灵敏度是多少，能否达到检测所需。

二、ELISA实验攻略
（一）、ELISA实验样本

1、样本类型

（1）最常见的类型：细胞培养上清和血清血浆

（2）稀有的类型：尿液、胸腹水、唾液、脑脊液、组织匀浆液

2、样本的取样

（1）取样前应查资料确定待测指标在所属样本类型中的稳定性如何，保存条件如何。

一般而言，蛋白在溶液都是容易降解的，如能取样后立刻测定，效果最好。理论上来说，标本短期内，如48小时内检测，可放置4℃保存，保存时间超过两天，须放置-20℃或-70℃冻存，注意避免反复冻融。一般而言，-20℃冻存可保存样本一个月，-70℃冻存可保存样本5个月。但对不同样本类型来说也不尽然，细胞上清样本含杂蛋白较少，血清血浆含杂蛋白较多，保护作用较好，保存时间可稍长一些。从实际检测经验来看，无论血清血浆样本还是细胞上清标本冻存时间无论-20℃还是-70℃，最好不要超过1个月结果才比较准确。

不同待测蛋白样本处理方式可能有一些差别，如TNF-α的血清血浆样本，如果取样后不能马上检测，最好在半小时内将样本冻存。具体的样本处理请实验者提前收集相关信息。

（2）取样前应清楚所用检测的试剂盒的上样量是多少，实验做不做复孔，一般来说，取样量为三份，一份用作检测，另二份用作备份。每份样本的量，一般以2.5倍试剂盒的加样量（如做复孔）留存。如所用的试剂盒上样量为100μl，一般取250μl至样品管中，200μl加样，多余的50μl预留，防止样本在样品管壁上的粘附等造成实验时取样量不够。两份备份是为防止因待测样本中的目标检测蛋白超过试剂盒的检测范围而进一步稀释检测和重复验证。

（3）取样时注意无菌操作。血清血浆样本还要注意样本应该是无溶血，无重度黄疸，还要注意使用试剂盒建议的含哪种抗凝剂的采血管。

（4）细胞上清、胸腹水、脑脊液样本的采集。需要离心去除细胞，防止样本内留存细胞，解冻后细胞破裂，内源性过氧化物酶会影响检测结果

（5）组织匀浆液的样本，要制备过程中需要在缓冲液中加入蛋白酶抑制剂。防止蛋白成份被内源性蛋白酶降解，造成检测结果的值偏低。因组织匀浆液的样本蛋白种类多，含量丰富，试剂盒一般以能做血清血浆标本的试剂盒来参照血清血浆的检测方法进行，否则就会影响实验结果。

3、样本的检测

（1）检测前应确定试剂盒检测样本类型，能否检测血清血浆标本（如自己的检测样本类型为血清血浆标本）。

（2）冻存的样本，如解冻检测，在解冻溶解后，应上下颠倒充分混匀，以防止因局部蛋白浓度过高造成检测结果不准确，避免剧烈振荡。

（3）实验前应先通过查文献等方法来确定采集样本中待测目标蛋白的浓度大致范围，与试剂盒检测限做比较，如差异过大或把握不准，应先做预实验以确定能否直接上样。ELISA的本质是抗原抗体反应，体系确定的最佳检测范围内可近似看作是一个直线，待测目标蛋白浓度超过较多后，并不成线性比例，所以得出的结果误差较大。

（二）、ELISA实验过程的注意事项

1、实验前的准备

（1）仔细阅读说明书，按说明书要求做洗涤液的稀释、孵育温箱的准备、试剂平衡到室温、通过计算取出所需的预包被板条等。如一个试剂盒多次使用，最好将检测抗体、标准品稀释液、酶、底物等组分取所需的量在实验过程中加入该组分前进行平衡，防止因加液次数较多，盖子打开时间较长而染菌，同时也避免因多次平衡，重复复温而影响后续的贮存。

（2）样本编号，排列整齐（便于加样），如是冻存的样本，需提前解冻并上下颠倒混匀。

（3）按说明书复溶标准品，一般而言，冻存的标准品，复溶温度是室温，时间15分钟以上，并且注意上下颠倒混匀。

（4）每次实验均需做标准曲线，作用有两个：第一，用样本实验条件相同的标准曲线来计算结果；第二，如果实验没有达到理想的结果，通过已知的标准品是否成功做出结果判定实验过程成功与否，此步骤相当于实验操作的质控。

2、实验过程

2.1、加样本或加其它成份

（1）加样本的过程，按已排列好的标本序号加入，可避免出错；

（2）每个不同样本均需换移液器枪头；

（3）用移液器吸取样本前应抽吸一下浸润管壁，防止加样后，样本残留在管壁而造成实际加样量的不足，提高加样的准确性；

（4）加样本或其它成份时，抽吸和加液应该缓慢，防止因过快而造成管内残留成份较多，结果不准确，同时避免气泡产生。

（5）如果一次检测的量不多，应尽可能按需取出试剂盒的检测抗体、酶和底物来平衡到室温，可避免该类组分不断改变贮存条件和降低染菌的机率。

（6）检测抗体、酶和底物，因同一种试剂盒中不同样本孔加样一致，可不换枪头，但最好是用排枪或多孔道加液器，缩短因加样造成的孵育时间的不一致，该差异可能导致结果有差异。

（7）每个组分加样完成后，手持酶标板，轻轻磕碰硬质物体边缘（如桌子，实验台等），使加入的液体组分更均匀。

（8）每个试剂盒的组分都是按最佳配比来提供，请不要随意更换不同批号或不同试剂盒里的组成。

2.2、孵育时间和温度

（1）孵育时间应以说明书提供的为准，该试剂盒的不同组分的孵育时间均是经过实验验证最佳时间，时间不足会造成抗原抗体反应达不到平衡，时间过长也会使抗体抗原过度反应，均会降低检测结果的准确性。

（2）孵育温度必须以说明书提供的为准，因为不同抗体与抗原反应的最适温度是不同的，理论上抗原抗体反应的最适温度是37℃，但并不是所有抗原抗体反应的最适温度均是如此，同时，反应温度与孵育时间密切相关，温度越高，到达平衡的时间越短，随意改变孵育温度而不改变孵育时间，可能造成抗原抗体反应没有达到平衡或过度反应。

（3）孵育过程最好是在局部恒温的小环境中，并且有鼓风的那种恒温箱，这样，温度更均匀。

（4）必须使用板帖，减少蒸发，否则会造成检测结果的不准确。并且加入不同组分后需更换新的板帖防止残留上一组分的影响。该过程也可将加好不同组分的酶标板置于干净的密封袋密封孵育，在相对较小的空间内，水份达到饱和后不再挥发，也可达到同样的效果。

2.3、洗板

（1）洗板的次数应严格按说明书操作，建议用自动洗板机，设置洗板间隔15秒左右为宜，如一次实验做的样本比较少，建议增加洗板间隔时间。

（2）如手工洗板，洗板间隔同上或更长。加洗涤液时，可用排枪。加洗涤液时，可稍提高枪头的高度，并稍微加快一点洗涤液的加入速度，使得洗涤液入样品孔时有少许“冲力”，以保证洗涤效果。

（3）最后一次洗板，去除洗涤液后，必须在干净的无粉尘的吸水纸上使劲拍打，确保无洗涤液残留。并及时加入下一组分，避免样品孔的干燥。

2.4、其它注意事项

（1）一次检测没有用完全部试剂盒，加不同组分时注意避免染菌。

（2）HRP酶及底物的孵育需要避光，避免有金属和氧化剂与底物的接触，特别是不能用铝箔来盖板。

3、实验结果的获得及实验数据的处理

3.1、实验结果的获得

（1）读取OD值应在说明规定的时间内读取，如酶标仪没有混旋功能，请读数前手持酶标板，轻轻磕碰硬质物体边缘（如桌子，实验台等），使中止后的颜色更均匀。

（2）一般以HRP和TMB催化显色系统来说，中止后的颜色是黄色，选取450nm波长的滤光片检测。如酶标仪有双波长较验的功能，可选择572或590nm的波长，以消除板底可能粘附的杂质对读数的影响。

（3）少数酶标仪读数时偏差较大，应间隔30秒左右再读数并保存数据，取最好的结果作为最终数据。

3.2、实验数据的处理

（1）平行复孔结果应取平均值作为最终数据。如平行的复孔差异过大（超过20%以上）则应重新测定。

（2）样本的OD值如超过标准曲线上的最高浓度，则应考虑稀释后重新测定，结果计算时应乘上稀释倍数。

（3）如因洗板，孵育时间或孵育温度没达到最佳效果等原因，造成标准品OD值偏离正常的范围（与说明书上建议的标准曲线相比，曲线趋势仍在），可以实测的标准曲线OD值计算同次样本的检测结果。

（4）标本检测值超过标准曲线的最高浓度，建议稀释再测。因为ELISA反应过程是一个抗原抗体结合的过程，在给定的样品浓度范围内，可认为是样本中待测蛋白的浓度与最终OD值成正比关系，不在给定的浓度范围内，如再以正比关系进行计算，则误差较大，此点实验者可通过实验验证。

如果出现标本检测值超过标准曲线的最高浓度进一步稀释时，稀释的倍数如何确定呢？

根据经验，可按如下方法进行，将标准曲线最高值延长，近似计算出浓度后乘以2倍作为样本的浓度，除以给定标准曲线检测限的最高浓度，即为最低稀释倍数，当然实际稀释时一般以整数倍进行。

（三）、ELISA检测结果的计算

对ELISA试剂盒而言，除了常见的双抗体夹心法，还有竞争法，间接法。不同方法由检测目标物的特点及抗体特点不同来研发的。一般说来，双抗体夹心法检测的目标是蛋白或多肽，相对比较大，有两个不同的位点被不同的抗体（捕获抗体和检测抗体）识别。

对于小分子的化合物，如固醇类激素中的雌二醇，睾酮等，因为分子较小，所以没有足够的位点来提供两个抗体识别，所以只能用竞争法。小分子的化合物，一般说来，种属特异性不强，所以试剂盒一般无种属的区分。

1、检测小分子化合物的ELISA试剂盒检测结果的计算：

用来检测小分子的竞争法ELISA试剂盒，因为检测中由待测目标物与已知浓度目标物酶结合物的与抗体竞争性结合，所以标准曲线一般由目标物和其竞争性结合物与抗体结合的比率作为纵轴来做曲线。一般来说，小分子化合物的ELISA标准曲线的绘制采用半对数或双对数法拟合曲线。

用户在做完实验后，做结果的计算时，不宜采用曲线回归后用公式计算的方法计算最终浓度。因为采用半对数拟合曲线后，曲线中涉及到自然对数的计算，使计算公式在EXCEL中不太方便输入（EXCEL熟悉自然对数公式输入除外）。最直接的方法是，采用提供的半对数座标纸，用铅笔直接标点后，连接成曲线，由曲线对应的结合率直接读出浓度。

如果只是看看做出实验的效果如何，可通过提供的标准品做曲线，看最后的回归曲线的R平方值是否接近1，越接近1，说明回归的效果越好。具体方法如下：

（1）在EXCEL上输好已知浓度标准品，经实验做出的OD值及其对应的浓度值。

（2）选取整列OD值（因为是结合率计算，所以0浓度一般不选择），在插入栏中，选择图表，出现图表选择框，选择散点图，一直点击下一步到形成一个图表。

（3）将鼠标放在图表中非点上的任意区域，单击右键，选择图表选项栏，在网格线栏选择X轴的次要网格线，点击确定。

（4）将鼠标放在X轴上，单击右键，选择座标轴格式，在刻度栏中，在上部选择栏中选择10的倍数最大值、最小值、最大刻度及相交点，在下部选择栏中选择对数刻度。

（5）将鼠标放在Y轴上，单击右键，选择座标轴格式，在上部选择栏中选择最大值、最小值、最大刻度等（因为是结合率计算，所以最大值一般选择1）。

（6）右单击任意点，选择添加趋势线，在类型栏中选择指数或对数，在选项栏中选择显示公式和显示R平方值，确定即可。

2、检测大分子蛋白等的ELISA试剂盒检测结果的计算：

对于大分子蛋白等待测物，常见的ELISA盒类型是双抗体夹心法，实验做完后，如何计算样本中所测目标物的浓度。实验成功与否，也可从标准曲线的角度来初步判断实验过程的操作是否成功。

做标准曲线的具体方法如下：

（1）在EXCEL上输好已知浓度标准品，经实验做出的OD值及其对应的浓度值。

（2）选取整列OD值，在插入栏中，选择图表，出现图表选择框，选择拆线图，点击下一步，在系列栏中，分类X轴标志点击最右边图标，形成一个输入柜，选择OD值对应的浓度值，回车后点击下一步，直到形成一个图表。

（3）右单击拆线任意位置，选择添加趋势线，在类型栏中选择多项式同时选择阶数，在选项栏中选择显示公式和显示R平方值，确定即可。

（4）在选择阶数上，系统默认的是2次，如果曲线的R平方值偏离较多，可选择3阶多项式。

3、实验后样本中待测目标物浓度的计算：

对于机器读出的OD值后，最经典的方法就是用座标纸画出已知浓度标准品的OD值的点，连接成光滑的曲线，其中X轴是浓度，Y轴是OD值。只要通过OD值在曲线上的点就可读出其对应的浓度。但该方法需要手工作图，并且估读后，有一定的误差。

现在由于电脑的普及和运用，已可运用EXCEL表格进行回归曲线和计算了，具体方法如下：

（1）在EXCEL上输好已知浓度标准品，经实验做出的OD值及其对应的浓度值。

（2）选取整列OD值，在插入栏中，选择图表，出现图表选择框，选择散点图，点击下一步，在系列栏中，X值输入框点击最右边图标，形成一个输入框，选择OD值所在的列，Y值输入框点击最右边图标，形成一个输入框，选择OD对应的浓度值，回车后点击下一步，直到形成一个图表。

（3）右单击拆线任意位置，选择添加趋势线，在类型栏中选择多项式同时选择阶数，在选项栏中选择显示公式和显示R平方值，确定。

（4）在空白处选择输入函数的“＝”后，开始输入回归得出的函数，其X值以实验得出的某一数值所在的框代替，即遇到X时，就点击实验得出的某一OD值（一般取第一行第一列的OD值），直到输入完整的函数，回车后得出的值即为该OD值对应的浓度值。选择向下拖动后，可直接完成整个实验得出所有的数值计算，比较方便。

（5）本方法的核心是将OD值作为X值，浓度作为Y值，所以在选择X值和Y值时注意对应的关系。

在实际使用过程中，如果曲线回归后拟合不好，即R平方值偏离1较大，则最后计算的结果中，比较靠近曲线低值部分偏离较大，造成“计算”成负值的现象。对此，可修改拟合曲线时的阶数，尽量使曲线接近1。另一种办法是用前面提到的经典方法将靠近曲线低值部分的OD值进行估算。