如何做好病毒空斑实验

       如何做好病毒空斑实验？

       以乙型脑炎病毒感染BHK-21细胞为例

       第一步：溶液配制

　　1、2％羧甲基纤维素纳覆盖培养基：先取4g粉状羧甲基纤维素纳溶入100ml蒸馏水，高温高压灭菌，再放入冰箱。使用前无菌操作按1：1比例加入2倍DMEM培养基（含有2%FBS和1%双抗），混匀放入冰箱，过一天后再拿出，反复摇匀，使纤维素达到一种匀质的状态，静置至泡沫完全消失后使用。

　　2、结晶紫：取0.34g粉剂加到15ml 95% 医用酒精中，溶解后再用蒸馏水定溶到100ml。

　　第二步：空斑实验

　　1、BHK-21细胞培养；

　　2、对BHK-21细胞进行计数，按一定比例接入24孔板；

　　3、24h后，弃培养液，用PBS洗两次；

　　4、接种乙型脑炎病毒：接种病毒液0.1ml/孔，病毒液按10倍梯度稀释，可以做重复；

　　5、放入37度5％CO2培养箱1h，期间每15min慢摇一次，使病毒充分吸附；

　　6、弃病毒液，用PBS洗涤细胞三次。加入2％羧甲基纤维素纳覆盖培养基（1ml/孔），放入37度5％CO2培养箱继续培养；

　　7、3天后，吸弃培养基；

　　8、加入5％甲醛1ml/孔固定4min，弃甲醛，加入结晶紫0.8ml/孔染色20min；

　　9、蒸馏水缓缓冲洗染液，计算空斑数。

　　注意事项：2％羧甲基纤维素纳覆盖培养基在配制过程中一定要充分摇匀；病毒吸附后一定要洗涤，以防后期空斑数不准确；接毒后的细胞培养时间不同病毒会有不同，按实际情况来处理；避免多次观察细胞培养板，会很容易造成病毒移位，空斑变大。

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