全基因组测序揭示人类生活“健康杀手”金黄色葡萄球菌的分子特征

      金黄色葡萄球菌是常见的食源性致病菌，广泛存在于自然环境中。金黄色葡萄球菌 在适当的条件下，能够产生肠毒素，引起食物中毒。近几年，金黄色葡萄球菌引发的食物中毒报道层出不穷，由金黄色葡萄球菌引起的食物中毒占食源性微生物食物中毒事件的 25%左右，这种病菌主要生长在37摄氏度左右的地方，并且耐高盐，即使是盐分浓度高达10%也是可以生存。金黄色葡萄球菌主要是在人体的皮肤、口腔、咽喉或者是肠胃当中寄生，在空气、污水等环境中也无处不在。

      金黄色葡萄球菌感染对人类的巨大威胁主要是由于抗生素耐药性和高毒力分离株的迅速出现。目前已有的研究一般都集中在金黄色葡萄球菌ST630的分子流行病学上，很少涉及全基因组和WTA生物合成基因。通过全基因测序可以分析ST630的分子特征，有助于了解金黄色葡萄球菌中新致病菌株的出现和多样化。

1 基因组测序、组装和注释

      本研究收集16株临床金黄色葡萄球菌分离株。WH39（tagN编码）和WH52（非tagN编码）基因组如图1所示，将其他14株金黄色葡萄球菌分离株的未封闭基因组组装成28~530个序列。16株分离株的基因组大小在2659666bp~3040523bp之间，GC含量在32.50%~32.82%之间，预测编码序列（CDS）的数量在2653~3195个之间。此外，这些基因组还包含3~16个rRNA、19~60个tRNA和4~5个ncRNA。

                                    图1 菌株WH39（a）和WH52（b）染色体图谱

2 系统发育分析和脉冲场凝胶电泳（PFGE）分析

       作者共纳入37条金黄色葡萄球菌基因组序列进行系统发育分析。通过蛋白预测和同源性分析，在37个分离株中均鉴定出1711个同源基因。从1711个同源基因构建的系统发育树得出，ST395、ST1093和ST426与其他ST谱系的分支更大（图3）。此外，相较于ST395菌株，ST630与其他金黄色葡萄球菌谱系之间的遗传亲缘关系更接近。ST630分离株的PFGE共检测到11种PFGE类型，相似系数为82.7%~100.0%。不同的ST630分离株的DNA片段模式相似性超过80%，说明它们之间存在密切的亲缘关系。

                                                   图2 系统发育树

3 大多数ST630分离株具有独特的WTA生物合成基因和WTA结构

      与大多数表达RboP-WTA的金黄色葡萄球菌菌株相似，16株ST630菌株均含有tarO基因和tarAHGBXD基因簇，用于WTA的生物合成和WTA转运。RboP-a-GlcNAc糖基转移酶基因tarM在所有16株ST630菌株中均存在。BJ12和WH52也包含tarIJLFS簇，用于RboPWTA聚合和b-GlcNAc糖基化。值得注意的是，WH39、WH60、WH99、WH114、WH119、WH211、WH299、HN288、NX98、BJ95、RJ1267、110900和128254包含一个SaGroWI基因簇，取代了tarIJLFS基因簇。SaGroWI基因簇已被确定为负责GroPWTA的生物合成和a-GalNAc糖基化（tagN），而NXNE同时包含SaGroWI基因簇和tarIJLFS基因簇（图3）。且在多个CoNS中鉴定了这些基因的同源物。这表明ST630与CoNS之间存在进化联系。

       图3 ST630的基因组中WTA生物合成基因

      对WTA样品做PAGE分析，用阿利新蓝银染色观察发现WH52（非tagN编码）的WTA迁移速度快于WH39（tagN编码），说明tagN编码的ST630具有更复杂的WTA结构（图5）。此外，作者还在WH39中构建了一个tagN突变体（DTN）及其互补突变体（c-DTN）。PAGE结果表明，DTN的WTA迁移速度快于亲本分离株，与非tagN编码的ST630相似。c-DTN的WTA与野生型一样迁移，表明DTN可能缺乏WTA GalNAc残基。

                                             图4 PAGE电泳图

4 在WH39中发现的一种新的SCCmec元素

      WH39含有一个新的59kb的SCCmec元件，与位于CA-MRSA菌株（群落相关菌株）上的SCCmec V型的同源性有55.42%。新的SCCmec元件插入orfX基因的3’端，两侧有两个重复序列（DR1、DR3），包含65个开放阅读框（ORFs）。DR2在orfx基因下游38kb，划分为双结构域复合元件。前38kb的SCC区域由40个ORFs组成，包括mecA基因复合物和两个不同的ccrC基因。

5 原噬菌体分析

      预测表明，所有ST630菌株都含有至少一个原噬菌体，其长度范围从6.4 kb到47.8 kb。GC含量在26.06%~35.28%之间变化。一个与ST395特异性噬菌体（U187）密切相关的原噬菌体，能够介导金黄色葡萄球菌ST395和其他细菌物种之间的HGT，且仅在tagN、tarM编码的ST630分离株的所有有效基因组中检测到，而在非tagN编码的金黄色葡萄球菌ST630菌株WH52和BJ12中未检测到。此外，在tagN编码和非tagN编码的ST630菌株中均预测到了一些常见的原噬菌体，如UPT1028和UJay2Jay。通过blast分析，在tagN、tarM编码ST630分离株的6.4kb原噬菌体中观察到几个WTA生物合成基因，如WTA转移酶基因，进一步证明了WTA生物合成基因的流动性。

研究结论

      金黄色葡萄球菌种群大部分属于独立的进化谱系。许多毒力和抗性基因在MGEs上编码，MGEs的HGT促进了金黄色葡萄球菌的遗传和表型变异，对环境变化的适应有很强的影响。作者通过全基因组测序确定了金黄色葡萄球菌分离株的基因组序列，结合系统发育树、PAGE、SCCmec元件分析等发现金黄色葡萄球菌ST630分离株，可能同时产生RboP-GlcNAc WTA和GroP-GalNAc WTA。通过比较基因组分析表明，这种罕见的ST630容易从CoNS中获得DNA，并可能作为其他金黄色葡萄球菌和CoNS物种之间的基因转移站，从而为各种MGEs的种间HGT创造一条可能的新途径。

作者也提出了本研究存在一定的局限性：首先，ST630菌株的样本量较小，限制了本研究的广泛代表性。后续在实验中可以继续扩大样本量。其次，WGS只能提供序列信息和预测，而不能提供实际的WTA结构或基因转移水平。第三，目前尚不清楚其独特的WTA结构是否会影响致病性和免疫反应，这将是作者进一步研究的重点。

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