背景：由细胞学说我们可以知道，细胞是动植物的基本结构单位，也是生物进行生命活动的基本单位；在结构和组成上具有共同的基本特征。生物体的功能通过细胞的活动而实现；新细胞是从已经存在的旧细胞通过分裂而产生的。细胞功能失常，会导致生物体的病患。

最初认为，由一个细胞经过分裂分化而形成的组织是相同的。但研究发现，同一个组织所包含的细胞群体从表象和功能上都有所区别；分为不同的细胞亚群。即便是来源相同的单个细胞，由于环境因素也会造成不同基因的表达。从传统的显微镜观察，到高通量测序的使用；发展到如今的单细胞测序技术。

图1：细胞及细胞分裂分化而形成的组织

单细胞测序技术指在单个细胞水平上，对基因组、转录组、表观组等进行高通量测序分析的一项新技术。能够揭示单个细胞的基因结构及基因表达状态，反映细胞与细胞之间的差异。通过单细胞测序，能够解析机体不同组织器官的细胞图谱，在细胞层面探索它们的作用和发生发展过程。

单细胞测序可分为单细胞基因组测序，单细胞转录组测序，单细胞表观遗传组测序。其中最为常见的是单细胞转录组测序，基本流程为：1.分离单个细胞; 2.获得和处理 RNA ; 3.将 RNA 反转录形成 cDNA ; 4.扩增 cDNA ; 5.文库制备和测序; 6.数据处理和分析。

图2：单细胞转录组测序基本流程

心血管疾病是心脏和血管疾病的总称，主要包括缺血性心脏病，脑血管疾病，外周血管疾病和风湿性心脏病等。根据流行病学研究，心血管疾病占中国疾病死亡率的40%，并且在逐年上升。心血管疾病病因复杂，难以治疗，其中先天性和适应性免疫系统的激活及其对受影响组织的浸润已被证明能够引起各种心血管疾病，包括动脉粥样硬化斑块，缺血性和非缺血性心肌病以及高血压病。

图3：心血管疾病的发病历程及分子机制

动脉粥样硬化是动脉血管壁的一种慢性炎症性疾病，主要成分包括内皮细胞、平滑肌细胞、巨噬细胞、淋巴细胞和沉积的脂质及各种胶原、弹性纤维等。由大动脉和中型动脉内膜中低密度脂蛋白的保留和修饰引发，激活内皮并促进免疫细胞浸润。T细胞作为一种免疫调节细胞,在动脉粥样硬化的发展及斑块形成中发挥重要作用。

图4：动脉粥样硬化形成的分子机制

对18例患者(男性77%)通过单细胞转录组测序鉴定人动脉粥样硬化斑块中14种不同的细胞群。T细胞是数据集中丰富的群体，占所有分析细胞的52.4%，而髓系群体占所有细胞的18.5%。再根据不同的分化和激活状态对 CD4⁺ T细胞进行亚聚类，从而确定了5个不同亚群，其中两个亚群呈现细胞毒性基因表达谱，高表达GZMK和PRF1，此外，这一簇中的基因表达证实了与适应性免疫反应相关的促炎通路的富集。在细胞间通讯促进斑块内的炎症中发现，髓系细胞、内皮细胞和平滑肌细胞相互作用的绝对数高，淋巴细胞和肥大细胞的潜在相互作用的绝对数低。

图5：人动脉粥样硬化斑块中T细胞表达亚群及细胞通讯

主动脉是最大的动脉血管，分为外膜、中膜和内膜三层，其中外膜主要由包绕的结缔组织、分布的神经末梢、弹力膜等构成，中膜主要由平滑肌细胞及细胞外基质构成，内膜主要由内皮细胞构成。由高血压和动脉粥样硬化会诱发主动脉夹层；主动脉夹层主要是主动脉腔内的血流从内膜撕裂口进入中膜，在血管壁分裂成真、假腔而形成。其发病基础主要在中膜结构发生异常，也就是平滑肌细胞发生退变。

图6 ：主动脉夹层的成因

通过单细胞转录组测序和免疫多色染色技术，描述了正常人胸主动脉和主动脉夹层患者病变血管中细胞亚群组成及其空间位置，同时研究发现主动脉夹层标本中高表达的LOX成纤维细胞亚群（FB2）表达谱会随着AD病理发展进程显著变化；导致其与血管平滑肌细胞（VSMC）的异常细胞亚群产生相互作用，共同促进AD发展。筛选出了FB2特异性分泌蛋白COL5A1，并验证其在主动脉夹层患者血浆中的浓度显著高于对照组，阐述其作为血液生物标志物的可能性。

图7. LOX成纤维细胞亚群（FB2）表达谱及分泌蛋白COL5A1

人在衰老过程中，组成人体（包括心脏）细胞的DNA会不断积累错误，这种错误也称体细胞突变。虽然有些体细胞突变似乎影响甚微，但另一些体细胞突变能诱发癌症，或有可能促进生理上的衰老。心肌细胞内积累的体细胞突变可能会促进细胞功能退化。

图8a：心脏在衰老过程中基因的表达变化

单细胞全基因组测序技术鉴定了人类心脏在衰老过程中的体细胞突变，发现心肌细胞的体细胞单核苷酸突变（sSNV）会随着年龄的增长比许多分裂细胞和非分裂神经元以更快的速度积累。而且，心肌细胞具有提示DNA氧化损伤和DNA修复机制受损的突变以及碱基替换增加的突变特征，所有这些都会随年龄增长而累积。由于年龄积累的sSNV会产生许多破坏基因功能的突变，因此心肌细胞中的多倍体化可能提供一种遗传补偿机制，以最大限度地减少衰老过程中必需基因的功能缺失。

图9. 心肌细胞的体细胞单核苷酸突变水平

心肌梗死是指在冠状动脉病变基础上，冠状动脉供血突然减少或中断引发血栓，从而导致的心肌缺血性坏死。心肌梗死的发病率及死亡率的趋势逐年增加，心肌梗死的发病机制和病理生理学复杂，伴随着心脏血流动力学改变，涉及炎症、凋亡、氧化应激、免疫代谢等多个方面。心肌梗死后的炎症反应严重影响心脏愈合和心脏重塑, 因此靶向梗死后免疫调节可能改善预后。

图10.心肌梗死的基因表达水平

通过单细胞RNA测序(scRNA-seq)和空间转录组学相结合，探索心肌梗死小鼠模型中相关的免疫细胞时空动态。通过scRNA-seq鉴定出12个主要的免疫细胞群，并且这些细胞群的比例在心肌梗死后发生动态改变。其中巨噬细胞是最丰富的群体，通过轨迹分析发现，心肌梗死后晚期巨噬细胞中Trem2的表达上调，体内注射可溶性Trem2可显著改善梗死心脏的功能和结构。通过进一步研究Trem2信号通路的调控因子，将有利于探索心肌梗死后心衰的新治疗策略。

图11.心肌梗死小鼠模型的免疫细胞群及Trem2的改善作用

单细胞测序技术目前还存在不足：1.单个细胞的获取，目前采用物理和化学酶解组织制备单细胞悬液，这个过程会导致细胞损伤，对测序结果造成影响。2.动物模型的适配性，动物模型与人类疾病的发展进程无法完全匹配；因此测序结果的参考意义有待加强。3. 单细胞细胞的捕获效率和测序覆盖度低，导致了信息捕获的减少与成本的升高。4. 测序后的生信分析方法仍需规范，因为不同的分析方法出现的结果不同，需要改进算法。

主要参考文献：

1. Circulation Research. 2020, 127:1437–1455.

2. Trends in Cardiovascular Medicine. 2022, 32:127–135.

3. Nature Communications. 2022, 13(1):4580.

4. Theranostics. 2022, 12(2): 910-928.

5. Nature Aging. 2022, 2(8):714-725.

6. Computational and Structural Biotechnology Journal. 2023, 21:2717–2731.