Single-cell and spatial transcriptomics analysis of non-small cell lung cancer. Nat Commun. 2024;15(1):4388. Published 2024 May 23. doi:10.1038/s41467-024-48700-8

研究背景：

肺癌是全球第二大常见癌症，也是癌症死亡的首要原因，晚期患者的5年生存率约为 6%。非小细胞肺癌（NSCLC）是最常见的肺癌类型（约占总病例的 85%），其次是小细胞肺癌（占总病例的 15%）。肺癌是一种复杂的疾病，其中肿瘤微环境起着关键作用，巨噬细胞与疾病进展密切相关。特别是肿瘤相关巨噬细胞（TAM）可以发挥双重作用，通过抑制免疫反应、促进血管生成和帮助组织重塑来促进肿瘤，同时通过促进炎症和对癌细胞进行细胞毒性活动来抑制肿瘤。肺癌和巨噬细胞之间错综复杂的相互作用凸显了了解它们的动态关系以制定更有效的治疗策略的重要性。在该研究中，通过单细胞和空间转录组学分析了25名未经治疗的腺癌和鳞状细胞癌患者的约900,000个细胞，来识别肿瘤微环境中巨噬细胞表型的变化。

在 NSCLC 中，肺腺癌 (LUAD) 是最常见的组织学亚型，其次是肺鳞癌 (LUSC)。过去十年在发现预测性生物标志物方面取得的进展为基于肿瘤组织学和PDL1表达的靶向治疗和免疫治疗领域的新治疗前景铺平了道路。

为了确定LUAD和LUSC中免疫和非免疫细胞状态的异质性及其空间景观，本文作者收集了25名未经治疗的 LUAD（n  = 13）、LUSC（n  = 8）或未确定的肺癌（LC，n  = 4）患者和两名健康死亡捐赠者的肺组织切除物。作者收集了肿瘤和匹配的正常非致瘤组织，分离的CD45+免疫细胞以及肿瘤和其他非免疫群体，并进行了scRNA测序。此外，使用10x Genomics Visium平台对来自8名患者（上述25名患者中的8名）的肿瘤和背景组织切片进行空间转录组学处理（共n = 36个切片）。

图1：单细胞转录组学揭示了NSCLC的异质性

      在对scRNA-seq数据集进行质量控制后，作者总共确定了895,806个高质量细胞，其中 503,549个来自肿瘤，392,257个来自背景及健康组织（以下称为B/H）。在进行归一化和log1p变换、高变异基因选择、降维、批次校正、莱顿算法聚类后，来自肿瘤和B/H的细胞分别被注释为不同的大细胞类型。鉴定了具有单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞以及肥大细胞、自然杀伤细胞、T细胞、B细胞和非免疫细胞转录特征的髓系细胞集群。作者没有检测到中性粒细胞，很可能是因为它们在采集后容易降解，尤其是冻融循环中。最后，作者确定了一个以髓系（LYZ、CD68、CD14、MRC1）和上皮基因（KRT19、EPCAM）共同表达为特征的集群。这些细胞是在肿瘤内发现的，与之前描述的癌症相关巨噬细胞样细胞（CAML）具有相似性，在包括NSCLC在内的各种恶性肿瘤患者的血液样本中都观察到了这些独特的细胞。所有集群都包括来自多个患者的细胞，集群大小从2520个细胞到124,459个细胞不等。

      肿瘤与本底之间的免疫和非免疫区的组成明显不同。在肿瘤中，作者检测到了成纤维细胞，淋巴内皮细胞（LECs）的比例有所下降。此外，上皮细胞群显示出更高的多样性，在肿瘤组织中存在肺泡 II 型（AT2）、上皮标志物（KRT19、EPCAM、CDH1）下调的非典型上皮细胞、骨髓标志物（LYZ）上调的过渡上皮细胞和循环上皮细胞。这些差异与肿瘤标本中上皮细胞很可能是突变肿瘤细胞和非突变正常细胞的混合物这一事实一致，并表明肿瘤转化会导致细胞状态的进一步多样化。

图2：综合单细胞和空间转录组学揭示了LUAD和LUSC中的相互作用网络

LUAD和LUSC的预后非常不同，为了研究临床特征的差异是否源于不同的细胞组成，作者比较了LUAD和LUSC患者 CD235- 样本中免疫和非免疫细胞亚群的频率，虽有微小差异，但无显著性。此外，在患者体内观察到的免疫细胞和非免疫细胞的频率与癌症亚型、癌症分期或性别之间没有明显的关联，这表明LUAD和LUSC的TME组成相当相似。同时，作者研究了LUAD和LUSC的TME中是否存在不同的细胞间相互作用网络。为此，作者利用CellPhoneDB推断了在本底或健康细胞中未检测到的具有统计学意义的配体-受体对（L-R）及其相应细胞类型，从而确定了在每种肿瘤类型环境中专门观察到的细胞-细胞相互作用的推定列表。

重要的L-R及其相互作用的细胞类型是根据使用CellPhoneDB从scRNA-seq数据集中得到的不同细胞类型群中基因的共表达计算出来的。然而，为了辨别具有生物学意义的相互作用，必须确定被识别为相互作用的细胞类型是否确实在物理上位于同一位置。为此，作者考虑了scRNA-seq确定的细胞类型在组织切片上的空间排列方式。作者采用了一种综合方法，将肿瘤和本底样本的scRNA-seq与新鲜冷冻肿瘤和本底组织切片的空间转录组（STx）图谱相结合。作者对来自8名患者的两个连续的10 μm切片进行了10× Visium分析，其中7个切片与用于scRNA-seq的样本相匹配。作者共分析了肿瘤切片20个，背景切片16个，肿瘤切片的平均UMI数为6894/点，背景切片的平均UMI数为3350/点。接下来，作者利用来自scRNA-seq数据集的cell2location和细胞类型特异性表达谱来解构组织中的细胞类型丰度。

图3：10x Visium验证关键配体-受体对的空间共定位

组织切片上的细胞类型确定后，作者检查了肿瘤和背景组织所有切片中不同细胞类型的频率。肿瘤组织和背景组织中细胞类型的丰度是通过对通过质量控制的切片中cell2location估计细胞丰度的后5%量化值（q05）求和而计算得出的。作者的分析证实，所有切片中肿瘤与背景细胞类型频率的差异与scRNA-seq数据的结果一致。同时，与scRNA-seq研究相比，Visium的差异可能来自肿瘤切除位置的不同以及样本量的差异。尽管如此，scRNA-seq 和Visium得出的结果总体上是一致的，这表明作者的不同细胞类型空间“地图”忠实地反映了它们在组织中的分布。

图4：CAMLs共享肿瘤CNAs并与肿瘤细胞共定位

巨噬细胞在传统上分为不同的 M1（经典活化）和 M2（替代活化）表型，现在的理解是，巨噬细胞存在于功能状态的动态范围内。这种巨噬细胞可塑性的概念强调了它们根据微环境的复杂线索在促炎和抗炎作用之间无缝转换的能力。为了更好地了解不同的巨噬细胞群体在TME中发生的转录变化，作者进行了DEA。在肿瘤中，与背景组织相比，AMɸ和AIMɸ均上调了涉及胆固醇和脂质转运及代谢的基因。由于癌细胞增殖过程中需要大量新合成的细胞膜，胆固醇在肿瘤生长过程中起着至关重要的作用。在作者的数据集中，作者检测到胆固醇输出因子ABCA1在AMɸ和AIMɸ中表达较高，而低密度脂蛋白受体（LDLR）没有表达，后者负责将携带胆固醇的脂蛋白颗粒吸收到细胞中，这表明胆固醇优先从TAMs输出到 TME。有趣的是，作者还注意到TREM2在AMɸ 和AIMɸ中的高表达，TREM2在小胶质细胞胆固醇外流中发挥着重要作用。为了验证TME中胆固醇水平的增加，作者用 BODIPY™ 493/503对匹配的肿瘤和背景组织切片进行了染色，这是一种针对胆固醇和其他中性脂质的染色剂。作者发现，与背景组织相比，肿瘤切片中的 BODIPY 信号明显增加，证实肿瘤中的中性脂质增加了，这可能是TAMs输出增加的结果。

图5：肿瘤巨噬细胞经历肿瘤胚胎重编程

胚胎发育与肿瘤组织有许多共同特征，包括快速的细胞分裂、细胞灵活性和高度血管化的微环境。最近有报道称，在肿瘤发生过程中，Mɸ可进行胎盘重编程并获得类似胎儿的转录特性，从而支持肿瘤的生长和转移。考虑到一些STAB1标志基因通常由胎儿Mɸ表达，作者希望探索肿瘤来源的STAB1 + Mɸ和从人胎肺中分离的Mɸ之间是否存在进一步的转录共性。为此，作者使用Harmony将数据集中的肿瘤和背景来源髓系细胞（n = 347,364个细胞）与公开胎肺scRNA-seq数据集中的髓系细胞和祖细胞（n = 6,947 个细胞）结合起来。接下来，作者对邻域图进行了莱顿聚类，并研究了细胞类型在聚类中的分布情况。为了研究细胞基因表达谱的相似性，作者采用了分层聚类，并在分层聚类的完全链接标准下，通过估计细胞类型之间在协调 PC 嵌入空间上的相关距离，建立了一个树枝图。

图6 ：STAB1  + 肿瘤细胞经历肿瘤胚胎重编程

LUAD和LUSC是两种最常见的NSCLC亚型，它们的预后结果明显不同，并且已显示出针对亚型特异性治疗的潜力。尽管细胞类型组成相似，但作者观察到LUAD和LUSC之间几种ICI和抑制分子的共表达存在显著差异，这凸显了治疗机会。LUAD样本经常表达TIGIT和TIM3 ，而在LUSC中我们发现了推定的ICI CD96-NECTIN1。虽然针对TIGIT的不同晚期临床试验（包括针对受 NSCLC影响的患者）正在进行中，但TIM3和CD96方面的进展更为有限。数据表明LUAD和LUSC患者可能受益于针对TIM3、TIGIT和CD96等ICI的特定免疫疗法。