本期介绍的这篇文章是来自东京大学医学研究所再生医学学部的Hideki Taniguchi研究团队在Biomaterials上发表的，题为A pancreatic cancer organoid incorporating macrophages reveals the correlation between the diversity of tumor-associated macrophages and cancer cell survival的研究性论文。（https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/39348736/）

摘要：

        胰腺导管腺癌（PDAC）是一种预后不良的进行性癌症。它包含一个复杂的肿瘤微环境（TME），包括各种基质细胞类型，与其恶性程度高度相关。由于缺乏人类PDAC-TME的研究模型，此前人们对TME内的细胞通信较难了解。类器官技术的发展使得人们可以通过结合基质细胞和重构ECM网络来实现体外重建TME。

本文研究团队通过将患者来源的癌细胞与人诱导多能干细胞（hiPSC）来源的间充质细胞和内皮细胞共培养，在体外建立了PDAC的类器官，即融合胰腺癌类器官（FPCO）。他们还将来自THP-1细胞系的巨噬细胞M0-FPCO纳入其中，通过联合分析Bulk RNA-seq和单细胞RNA-seq，他们发现M0-FPCO （FPCO-Mac）中的巨噬细胞失去了促炎症的特征，获得了促血管生成的特征。而内皮细胞网络的形成增强。M0-FPCO中含有5个与人PDAC组织中相应TAM相似的TAM亚群，包括SPP1+-TAM，与肿瘤血管生成和细胞增殖相关。PDAC细胞可以在TAM存在的类器官中存活更长时间。与PDAC细胞增殖和存活时间延长一致，PDAC亚群具有增殖特征，如M0-FPCO增加。因此，通过纳入巨噬细胞建立的PDAC类器官，不仅可以概括TAM的多样性，也能明确TAM在内皮网络形成和PDAC细胞特性调节中的作用。

结果：

1.建立包括巨噬细胞在内的PDAC类器官

        为了确认髓系细胞的丰度，研究者们使用髓系细胞标志物CD11b的抗体，通过免疫荧光（IF）分析PDAC患者组织。

随即发现PDAC患者胰腺肿瘤区域的CD11b+细胞较之邻近正常区域明显富集（图1A和B）。基于这一发现，他们首次将巨噬细胞纳入PDAC类器官中，作为TME的主要组成部分。

他们使用THP-1细胞进行类器官培养，并用慢病毒kusabira-orange （KuO）追踪标记THP-1细胞，分选KuO阳性THP-1细胞（图1C）。为了生成含有巨噬细胞的类器官，他们利用THP-1细胞衍生的M0-Mac与PDAC细胞（用荧光素酶和GFP标记）、hipsc衍生的间充质细胞和内皮细胞（hiPSC-MCs和hiPSC-ECs）在超低附着板上共培养24小时，形成多细胞球体。随后，将其转入气液界面培养并维持6天（图1D）。KuO标记的巨噬细胞分布在FPCO内，如均匀的KuO信号所示（图1E右侧）。H&E染色显示，FPCO和M0-FPCO均能有效复制间质致密的PDAC的导管结构（图1F）。补充材料S1也证明了这种可重复性。

        为了分析类器官内巨噬细胞的细胞特性，他们从M0-FPCO中分离出KuO-Mac（图2）、RT-qPCR分析检测M1和M2标记物。结果显示，与细胞因子诱导的M1- Mac相比，M0-FPCO （FPCO-Mac）中的巨噬细胞表达CD80、CXCL10和TNFA等经典M1标记物，与M0-Mac相比，表达CD163、MRC1/CD206、IL10和CCL17等经典M2标记物（补充材料S2A）。但是，FPCO-Mac没有表现出细胞因子诱导的M2-Mac的典型基因表达模式。于是他们假设FPCO-Mac具有不同于M1或M2 mac的独特细胞群。

2.巨噬细胞在FPCO中的功能分析

通过Bulk-RNAseq，研究者们将FPCO-Mac的基因表达谱与细胞因子诱导的M1-Mac、M2- mac、M0-Mac和THP-1细胞的基因表达谱进行了比较（图1G）。由Bulk-RNAseq数据生成的主成分分析图表明，FPCO-Mac获得了明显特征（图1H）。因为FPCO-Mac表达的TAM标记物在M0-Mac和M0-Mac中均未表达，因此，他们认为FPCO-Mac的独特特征是由FPCO-TME诱导的。

通过IF分析共培养7天的M0-FPCO，并将其与人PDAC组织进行比较，结果表明，在M0-FPCO中，CD11b+CD163+细胞比CD11b+CD80+细胞更丰富，这与人PDAC组织相似（图2A和B），这表明CD163的大量表达可能是TAM的明确标志物。

基因集富集分析（GSEA）显示FPCO-Mac上调血管生成和缺氧过程，而炎症过程（如INF-γ反应）则下调。比较FPCO-Mac和M0-Mac之间的差异表达基因（DEGs），发现FPCO-Mac中血管发育基因和缺氧反应上调，而免疫反应相关基因下调（图2C）。除了转录组分析外，细胞因子阵列分析显示，几丁质酶-3样蛋白1 （CHI3L1）和骨桥蛋白（OPN）以及基质金属蛋白酶9 （MMP9）在M0-FPCO中增加（图2D），这与血管生成有关。表皮生长因子（EGF）在FPCO组的释放量高于M0-FPCO组。

IF检测M0-FPCO的血管结构显示，与FPCO相比，M0-FPCO中CD31阳性细胞更丰富且相互连接（图2E和F）；然而，M0-FPCO内部的微血管结构无法维持管状结构的通畅（图2G）。因此，FPCO- mac可以刺激M0- FPCO的血管生成；但并没有完全建立内皮细胞的完整性。

3.FPCO巨噬细胞促进癌细胞存活

        接下来，他们研究了TAMs影响癌细胞特征或维持癌症干细胞的可能性。观察到，在延长培养期间，与FPCO相比，M0-FPCO中的PDAC细胞数量略有增加（图3A和B）。

考虑到两个可能影响类器官内PDAC细胞增殖能力的潜在原因可能是PDAC细胞对培养基中提供的细胞因子的增强反应或是TAMs中存在细胞相互作用赋予PDAC细胞促增殖或抗细胞死亡特性。

于是他们在没有EGF和FBS（生长因子降低，GFR）的情况下维持FPCO和M0-FPCO培养 1周（图3C）。在没有外源性细胞因子的情况下（第7-14天），FPCO和M0-FPCO的宏观外观相似（图3D）；然而，定量分析显示，FPCO中的癌细胞数量在第10至14天之间减少，而在M0-FPCO中癌细胞数量保持不变（图3E）。来自不同患者的其他PDAC细胞之间也是一致现象，这表明PDAC细胞在M0-FPCO培养中维持的稳定性。

IF分析显示，与FPCO相比，M0-FPCO中存在更多的Ki67+DAPI+ CK19+细胞（图3F和G）。此外，由于PDAC细胞稀疏地位于FPCO中间，因此他们也检查了细胞凋亡。发现与M0-FPCO相比，FPCO中pMLKL阳性的PDAC细胞有所增加（图3H和I）。综合来看，这些结果表明FPCO- mac不仅促进PDAC细胞的增殖，而且有助于PDAC细胞的存活。

4.GFR-M0-FPCO中PDAC细胞表达与PDAC细胞存活相关的因子

        为了深入了解M0-FPCO长期维持的机制，研究者们通过Bulk-RNAseq对GFR-M0-FPCO中的PDAC细胞进行分析。比较第14天FPCO中的PDAC细胞和M0-FPCO中的PDAC细胞，发现与FPCO相比，M0-FPCO分离的PDAC细胞数量更多（图3E）。补充图也展示了M0-FPCO中细胞周期相关特征的增加。

        因此，他们比较M0- FPCO与FPCO中PDAC细胞在第7天和第14天的基因表达谱，选择了32个在TAMs存在下上调的基因，如图4A所示。其中，有几个基因与癌细胞增殖和抑制癌细胞死亡相关。基于TCGA数据集，他们发现这32个基因中有13个基因与PDAC患者的低生存率相关（图4B）。这些结果为M0-FPCO长期维持PDAC细胞的增殖和存活能力的机制提供了新思路。

5.M0-FPCO获得肿瘤相关巨噬细胞的多样性

         接下来他们使用单细胞RNAseq （scRNA-seq）对第14天的M0-FPCO进行分析，选择TAMs作为CD11b+细胞，并进行聚类分析，发现了来自M0-Mac的五个不同的TAMs亚群，包括SPP1、C1QC、TREM2、增殖、上皮样TAMs（图5A和B）。这些在PDAC患者组织也曾被报道。

根据scRNA-seq的数据，他们检测了TAMs是否特异性表达OPN、 CHI3L1和MMP9，在细胞因子阵列分析中，与FPCO相比，M0-FPCO中这些基因表达上调（图2D）。因此，在M0-FPCO中，巨噬细胞特异性分泌OPN、CHI3L1和MMP，而在巨噬细胞存在时，间充质细胞中可能会轻微上调FN1和COL1A1。

与细胞因子阵列数据（图2D）一致，M0-FPCO中SPP1的翻译产物OPN的分泌量更高，这进一步支持了SPP1- TAM是在M0-FPCO中出现的观点（图5D）。此外，利用人PDAC数据和M0-FPCO对骨髓细胞进行综合分析，结果显示PDAC-TAM和M0-FPCO均分为8个簇（图5E，图5E）。而且PDAC还含有树突状细胞和骨髓抑制细胞群，而这些在M0-FPCO中不存在。这些发现证实，该类器官模型可以准确概括人类PDAC组织中TAMs的多样性。

讨论：

        本文所构建的PDAC类器官，首次概括了TAMs的多样性，并通过Bulk-RNAseq联合scRNA-se揭示了每个TAMs功能及其对应的特定的亚群。这些发现可以为抗癌药物研发提供方向，为设计针对TAMs的药物筛选时作为有用工具。