本期介绍的是来自赫尔辛基大学的Olli Carpen和 Pipsa Saharinen教授团队于2024年12月3日发表在Nature Communications上的文章。https://doi.org/10.1038/s41467-024-54445-1。

摘要：

        内皮细胞（ECs）可以形成组织特异性屏障，助于癌细胞远处转移。然而，转移性生态位中ECs的分子调控机制尚不清楚。在这篇研究中，研究者们使用单细胞RNA测序（scRNASeq）分析了黑色素瘤细胞到达肺转移生态位6小时后ECs的转录重编程。他们发现了一个反应性毛细血管EC簇（rCap），rCap富集血管生成和炎症途径，在人肺数据集中也存在。而JAK-STAT激活的致癌Pim3激酶是rCap的标志物，同样在自发性转移模型中上调。而他们发现抑制PIM可增加血管渗漏和转移性，且能降低连接蛋白cadherin-5和连环蛋白α， β和δ从而损害EC屏障。这些结果表明了肺内皮的可塑性及其对PIM3的保护作用，这可能会削弱PIM抑制剂在癌症治疗中的效果。

结果：

1.反应性毛细血管内皮细胞在转移性肺中富集

        为了研究EC屏障在肺转移定殖过程中的调节作用，他们使用高侵袭性小鼠黑色素瘤模型B16-F10在同基因C57BL/6小鼠中诱导转移，尾静脉注射黑色素瘤细胞到小鼠体内，并观察肺部定植。他们发现注射几分钟后，在循环和肺毛细血管内检测黑色素瘤细胞，呈细胞簇状。6 h后肺内可见较小的黑色素瘤细胞簇和单个细胞，12 h后数量急剧下降。从第3天开始结节数量也逐渐增加。与门静脉注射诱导肝转移相比，尾静脉注射B16-F10后，肝转移的发生速度明显减慢，到第9天，肝脏表面仅出现少量小转移结节。

        为了研究EC转录组在转移定植的第一步的变化，在黑色素瘤细胞注射后6小时从肺中分离Pecam1+ EC，并进行scRNASeq（图1a、b）。他们将gCap集群分成四个集群。其中包括表达相应标记基因的动脉和静脉毛细血管（CapA和CapV）（图1c-d）。此外，发现了一个额外的EC簇，除了gCap标记外，它还表达了独特的簇标记，并且在小鼠黑色素瘤注射后6小时细胞数量增加，因此，我们将其命名为反应性毛细血管EC (rCap)（图1c-f)。图1g的RNA速度分析表明rCap簇来源于gCap，与rCap表达的gCap标记一致。

RT-qPCR结果也证实，注射B16-F10 6小时后，小鼠肺上皮细胞中rCap顶端标记（包括Pim3、Bcl3、inhbb、Osmr、Tmem252、Adamts9和Scarb1）显著上调（图1j）。这些结果表明，循环黑色素瘤细胞诱导gCap的快速转录变化，导致肿瘤细胞到达肺部6小时后反应性毛细血管EC簇的扩增。

2.rCaps上调血管生成和炎症通路

        为了可视化转移性血管生态位中内皮细胞的旁分泌信号网络，接下来他们使用CellChat工具分析了细胞间通讯并在热图中表示（图2）。进一步分析发现crECs中Vegf、Notch、胶原、内皮细胞粘附蛋白ESAM和激活素通路上调（图2b-d），这些结果表明肿瘤细胞重新连接旁分泌EC信号通路，在转移性肺中富集rCap。

KEGG和GSEA分析也显示，转移肺和对照肺之间差异表达（DE） rCap基因的炎症、细胞骨架、粘附和紧密连接途径被激活（图2e， f）。

此外，rCap上调血管生成标志物，如糖酵解酶Pfkfb3、Jak2。此外，GSEA还发现rCap中JAK-STAT信号通路被激活（图2f， g）。我们知道JAK-STAT通路可以调节肿瘤血管生成和转移，而两个重要的rCap标记物Pim3和Bcl3是JAK-STAT通路的直接转录靶点（图2 h)。综上所述，这些结果表明rCaps在浸润黑色素瘤细胞时增加，其特征是血管生成标记物和JAK-STAT-PIM3-BCL3通路的转录上调。

3.rCap标记物定位于肿瘤细胞附近

为了定位肺内的rCap，他们使用RNAscope®原位杂交（ISH）检测rCap标记物Pim3、Bcl3和Inhbb（图3a-c），用抗黑色素瘤标志物PMEL抗体检测B16-F10细胞，用Pecam1探针检测ECs。有趣的是，Inhbb和Bcl3在对照肺中表达较低，但在转移肺中，Pim3、Inhbb和Bcl3均表达丰富，尤其是在黑色素瘤细胞附近（图3d-h）。分别有46%和16%的Pecam1+ ECs对Pim3和Bcl3或Pim3和Inhbb均呈阳性，表明在黑色素瘤注射后6小时，肿瘤诱导了rCaps的上调（图3i -l）。此外，与对照组相比，静脉注射B16-F10 7小时后肺溶物中PIM3蛋白水平升高（图3m， n）。综上所述，rCap标记物定位于浸润癌细胞附近的肺内皮。

4.rCap标记物在自发性转移过程中上调

        为了验证rCap在转移过程中的调节作用，他们使用了自发转移模型，这比静脉注射肿瘤细胞更能展现转移过程。为此，他们将B16-F10皮下接种到C57BL/6中，并在第14天形成了血管化肿瘤（图4a）。肿瘤细胞接种后第14天，血液样本中检测到CTCs（图4b），这在第7天时未曾出现。与此一致的是，在癌细胞接种后的第14天，Pim3、Bcl3和Inhbb在肺上皮细胞中上调，而在第7天则没有上调（图4c）。

接下来，他们使用原位4T1乳腺肿瘤模型，该模型在BALB/c小鼠中形成血管化肿瘤并转移到肺和肝脏（图4d-h）。这些结果表明，在自发转移过程中，肿瘤细胞在继发器官或循环中诱导rCap标记物的上调，而这种作用不是由原发肿瘤引起的。

5.肿瘤细胞分泌因子诱导rCap标记物

为了进一步研究肿瘤细胞诱导rCap标记上调的机制，他们将人脐静脉内皮细胞（HUVECs）与稳定表达绿色荧光蛋白（GFP）的B16-F10黑色素瘤细胞共培养和流式分选（图4f-g）。有趣的是，与单独培养的HUVEC相比，共培养后的HUVEC中PIM3和INHBB的表达增加，这表明肿瘤细胞足以诱导rCap标记物的上调（图4j）。此外，来自B16-F10、4T1或Lewis肺癌（LLC）培养的条件培养基同样诱导了PIM3、INHBB和BCL3的表达，这表明多种癌细胞类型的分泌因子诱导了培养的ECs中rCap标志物的表达（图4k-m）。因此，他们使用Bulk RNA-Seq方法比较了对照组和B16-F10条件培养基中培养16小时的HUVECs。文章的补充图中也展示了DE基因的GSEA分析结果，充分支持了黑色素瘤细胞分泌因子塑造肺毛细血管内皮的结论——导致特定的转录信号，以及JAK-STAT通路的激活。

6.rCaps与小鼠肿瘤血管系统的相似性

 从前面的结果不难看出，与健康肺相比，转移性肺中rCap数量的增加以及rCap中血管生成标志物也上调，这促使研究者们开始探索rCap是否与肿瘤血管内皮相似。因此，他们分析了小鼠肺肿瘤EC Tax线上数据集，并发现尽管rCap标记物在肿瘤毛细血管中广泛表达，但rCap与PCV和缺口ECs的相似性最高。

7.rcap在人肺中形成明显的簇状结构

为了研究rCap是否也可以在人肺中发现，他们对小鼠肺EC数据集中的scRNASeq数据和人肺细胞图谱（HLCA）中的ECs进行了跨物种比较分析。通过分析来自健康肺和癌患者肺肿瘤邻近正常肺组织的EC亚群的scRNASeq数据，他们发现了一个额外的gCap簇，表达特定的标记物，包括ICAM1、EMP1、ARID5A和PIM3，并同样存在rCap基因特征的富集，表明它代表了人类rCap。

此外，在文章的补充图中他们也整合了人肺EC数据与他们的转移性小鼠肺EC数据，展示了rCap簇在小鼠和人类数据中共享约50%的rCap簇标记。

8.PIM3调节内皮屏障

接下来他们探究了PIM3的功能，通过使用PIM3 shRNA和选择性PIM抑制剂AZD-120815抑制HUVECs和BECs中的PIM激酶，发现与对照组（shScr）相比，沉默PIM3降低了EC表面粘附连接蛋白CDH5，并从内皮细胞-细胞连接处拆除钙粘蛋白-5和连环蛋白EC-EC连接的间隙，而CDH5的总水平不变，这表明PIM3特异性地维持了连接细胞表面定位的CDH5（图5a-e）。此外，与shScr ECs相比，连接CDH5与肌动蛋白细胞骨架的张力敏感α-catenin （CTNNA1）、β-catenin （CTNNB1）和δ-catenin （CTNND1）在shPIM3 ECs的细胞-细胞连接中也显著减少（图5f-m）。

AZD-1208处理的结果shPIM3沉默的结果一致（图6a， b）。这些结果表明，Pim3需要维持EC-EC连接的完整性，从而维持EC单层膜的屏障功能。

此外，为了研究PIM是否在体内也能调节连接复合体的完整性，他们对小鼠进行口服AZD-1208或载药5天，并对CDH5的厚肺切片进行染色（图6h -l）。对照小鼠肺泡毛细血管中EC-EC连接之间的CDH5染色是连续的，而AZD-1208处理小鼠的肺中观察到CDH5连接的间隙（图6h -l），这表明，与体外实验结果一致，PIM抑制降低了小鼠肺中EC-EC连接中的CDH5。

9.Pim抑制增加肺血管渗漏和转移

为了研究Pim介导的EC连接完整性调节在体内的功能意义，他们通过给小鼠口服Pim抑制剂AZD-1208三天，并通过注射70 kd荧光葡聚糖10分钟静脉注射来分析血管渗漏。结果发现AZD-1208处理的肺中有强葡聚糖信号，表明示踪剂渗漏，而对照组肺显示低信号，表明AZD-1208损害了肺中的EC屏障功能。

由于已知肺血管屏障对转移性肿瘤细胞形成障碍，他们接下来便对AZD-1208影响转移性黑色素瘤在肺部的定植进行了研究。首先静脉注射B16-F10黑色素瘤细胞，让其在肺部定植3天，然后每天给药AZD-1208治疗5天（图7a-d），发现AZD-1208增加了肺转移结节和渗漏的数量。这些结果表明，PIM抑制增加血管渗漏和转移性定植，但不影响转移结节形成后黑色素瘤的生长。

此外，他们在4T1和LLC注射前4-5天给小鼠注射AZD-1208，并在肿瘤细胞注射后7天和14天分别监测转移情况。发现AZD-1208增加了两种模型中转移结节的数量（图7e-j）。因此，他们的研究结果表明，癌症反应性EC标记物PIM3在癌细胞定形过程中保护EC屏障。而PIM抑制增加了不同癌症类型的血管渗漏和肺定植。

以上结果表明，通过结合scRNASeq、Bulk RNASeq和小鼠肺同系性肺泡间质转移模型，他们揭示了小鼠和人类肺部的反应性毛细血管EC特性，展现了肺内皮对肿瘤细胞的可塑性，证明了PIM3的屏障保护作用和PIM抑制剂对血管通透性的影响，可能部分解释了PIM抑制剂在癌症试验中疗效有限的原因,为后续的改善治疗提供新思路。