本期介绍来自复旦大学Jianhua Wang研究团队于2024年5月发表在Advanced Science（IF=14.3）杂志上，名为Integration Analysis of Single-Cell Multi-Omics Reveals Prostate Cancer Heterogeneity的文章。文章链接：https://doi.org/10.1002/advs.202305724。

背景：

前列腺癌（PCa）是一种广泛的异质性疾病，肿瘤微环境（TME）中存在复杂的细胞生态系统。前列腺癌TME中的肿瘤浸润免疫细胞是影响前列腺癌进展的一个重要因素。肿瘤浸润免疫细胞的组成具有高度异质性，在接受治疗前的前列腺组织中，抗原提呈细胞（APCs），如树突状细胞（DCs）、单核细胞或“M1”巨噬细胞的募集/活化可能有助于局部T细胞的活化。肿瘤浸润的调节性T细胞或肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）的募集/活化可减弱抗原识别，导致CD8+T细胞的细胞毒功能或增殖能力下降。除了肿瘤浸润的免疫细胞，基质细胞，特别是活化的成纤维细胞也在肿瘤微环境中具有重要的作用。在这项研究中，作者假设肿瘤和间质细胞之间的相互交流可能重塑肿瘤微环境并直接影响肿瘤进展。该研究整合了PCa患者和健康对照人群的单细胞RNA测序、空间转录组学和批量ATAC序列，以揭示肿瘤微环境对PCa进展的影响。

结果

1. 上皮细胞、淋巴细胞和髓系细胞是PCa微环境中的主要细胞类型

通过对6例未扩散前列腺癌（PCa-2~7）、1例神经内分泌前列腺癌（PCa-1）和1例正常前列腺组织（PCa-8）进行单细胞分析，分析前列腺癌组织中细胞组成和细胞转录状态的多样性。通过特定基因表达谱将77661个细胞分为9种不同的细胞类型（图A-E）。基于已建立的标记基因，将合并数据集中的细胞注释为上皮细胞、T细胞、髓样细胞、B细胞、成纤维细胞、内皮细胞、NK细胞、中性粒细胞和肥大细胞（图D和E）。

2. 上皮细胞亚群异质性和癌症上皮细胞进化的描述

根据KRT8和KRT18的表达水平鉴定上皮细胞（N = 32741），采用批校正和无监督聚类分析将其分为11个亚组（图A-C）。为了研究单细胞转录组是否与PCa的组织学特征一致，作者还对每个患者的HE染色进行了Gleason分级（图D）。不同细胞类型具有独特的基因标志物（图E和F）。KLK12是激肽释放酶家族的成员，在其他样本中几乎不表达，但在去势抵抗性前列腺癌（CRPC）患者中显著上调（图F）。10例CRPC患者中8例KLK12染色阳性，但20例激素敏感性前列腺癌（HSPC）患者中均未见阳性表达（图G）。空间转录组分析显示，神经内分泌前列腺癌（NEPC）患者稳定表达CHGA和SYP，而CRPC的独特标志物AMACR （p504s）和KLK12，在CRPC患者中显著升高（图H）。作者使用转座可及染色质（ATAC）测序和批量RNA测序方法，比较了低Gleason得分样本和高Gleason得分样本的全基因组染色质可及性。ATAC-Seq结果显示，随着PCa进展，雄激素受体（AR）靶基因（如KLK2、KLK3和FKBP5）的转录激活发生显著变化，并且与AR转录程序相关，而CRPC患者在KLK11和AMACR位点有更多可访问的染色质（图I和J）。

3. 靶向治疗产生不同的SOX9^High干细胞样上皮细胞

作者使用轨迹分析获得了两个上皮细胞亚群进化分支，模拟了PCa的肿瘤发生和进化（图A和B）。Club细胞是一种相对罕见的上皮细胞群，被认为具有癌症干细胞的特征。这里有3个Club细胞亚群被确定，OLFM4+KRT13+ club细胞（club细胞3）共表达管腔C细胞标志物PSCA、TACSTD2和KRT4 (CK4)；因此，该亚群被命名为OLFM4+CSC（图C和D）。SOX9High KLF5+club细胞群（club细胞1）主要富集于接受雄激素剥夺治疗（ADT）的1例患者（PCa-4）（图E）。空间转录组学证实ADT治疗患者的大部分上皮细胞（PCa-4）为club细胞（图F和G）。伪时间轨迹分析表明，MYC、SOX9和KLF5的过度激活可能是正常管腔细胞去分化为肿瘤干细胞的驱动因素（图J）。与 OLFM4+ CSC相比，SOX9High club细胞具有一定的干性特征或易发生转移（图K）。体外实验证实SOX9和KLF5是肿瘤干性的驱动因素（图L和M）。正常前列腺上皮细胞株RWPE-1中SOX9或KLF5激活可以促进β-catenin的核易位（图N）。ChIP-PCR和ChIP-Seq结果显示，CTNNB1是SOX9、KLF5和ELF3的直接靶点（图O和P）。

4. PCa微环境中肿瘤浸润淋巴细胞图谱和效应CD8+T细胞亚群的鉴定

根据已有的标记物，T细胞被分为7亚群（A）。浸润淋巴细胞多为CD8+ T淋巴细胞（图B和E）。CD8+T细胞亚群又被进一步分为7个亚群（图F和G）。功能性CD8+T细胞数量与Gleason得分呈负相关。PCa-1的CD8+ T淋巴细胞浸润最少，PCa-7为最多（图H）。CD8A与CXCR6在TCGA-PRAD队列中呈正相关（图I）。此外，随着前列腺癌的进展，CD8+T细胞逐渐失去CXCR6的表达（图J-L）。流式细胞术揭示CD8+CXCR6+淋巴细胞可通过细胞毒性颗粒蛋白介导靶细胞死亡（图M和N）。CD8+淋巴细胞中CXCR6的缺失可能加速癌症进展。

5. TAM-Macro-2是一种PCa特异性肿瘤相关巨噬细胞亚群，ADT诱导的IL1B-NLRP3巨噬细胞具有抗癌活性

PCa微环境中骨髓细胞被分为7个细胞亚群（图A-C）。IL1B-NLRP3和S100A9+巨噬细胞分别在PCa-4和PCa-6患者中富集（图C）。TAM Macro-2缺失CD86的表达，被证实该亚群不参与T细胞运输调节（图D）。与正常前列腺组织相比，恶性肿瘤组织中CD68+CD86 -巨噬细胞数量显著增加（图E和F）。巨噬细胞拟时间分析重建了2个不同的进化轨迹，揭示巨噬细胞在PCa微环境中有两种主要的发育和分化途径（图G和H）。ATF3和IL1B在细胞进化轨迹2中高度表达，LGALS1和LGALS3在细胞进化轨迹1中高度表达，表明进化轨迹倾向于免疫抑制或抗炎表型，轨迹2倾向于促炎表型（图I和J）。

6. 肿瘤内2种不同状态中性粒细胞矛盾的功能

根据NLPR3将中性粒细胞分为“活化中性粒细胞”和“无反应中性粒细胞”（图A-C）。晚期PCa-1患者无反应中性粒细胞比例明显增加（图D）。转录谱差异分析显示活化中性粒细胞亚群可能通过MHC Ⅱ类分子进行抗原呈递以及免疫细胞募集（图E）。通路富集分析提示，活化中性粒细胞亚群发挥抗癌作用，而无反应中性粒细胞可能扮演促癌角色（图F和G）。活化中性粒细胞中Top基因与与良好预后和总生存率相关，而无反应中性粒细胞中一些Top基因则与不良预后相关（图H-O）。

7. 成纤维细胞亚群异质性的作用

该研究基于独特的胶原和其他细胞外基质（ECM）分子表达谱将成纤维细胞分为5种不同的细胞类型（图A-D）。抗原提呈成纤维细胞是一个表达CD74、HLA-DPA1和IL7R的亚群，该亚群的比例随着Gleason得分的增加而增加（图E和F）。综合应用PDGFRA、FAP、Vimentin和ACTA2来识别PCa微环境中的成纤维细胞亚群，成功地从癌旁组织和HSPC患者中区分出纤维细胞，这些细胞中PDGFRA、FAP、Vimentin和α-SMA的表达水平显著降低。相反，在转移组织或mHSPC样本中，成纤维细胞高表达PDGFRA、FAP、Vimentin和a-SMA（图G）。细胞间通讯结果显示，成纤维细胞主要与髓系细胞和上皮细胞相互作用，其次是T细胞（图H）。TIGIT信号通路仅在成纤维细胞-T细胞通讯中发现，表明POSTN+CTHRC1+FAP+成纤维细胞可促进Treg存活或者分化（图I）。PCa小鼠模型证实，相比于对照组 (PB-Cre；Ptenflox/flox)，来自于dCKO (PB-Cre；Ptenflox/flox；Hic1flox/flox) 小鼠的成纤维细胞诱导Treg分化的能力更强（图J-L）。小鼠组织免疫荧光染色和人前列腺样本免疫组织化染色结果揭示FAP+成纤维细胞和FOXP3+ Treg细胞在空间上接近，表明两者可能直接相互作用（图M）。空间转录结果显示FAP+成纤维细胞与T细胞邻近，提示FAP+成纤维细胞可能与FOXP3+Treg直接相互作用（图N和O）。

总结

该研究对PCa进展过程中PCa单细胞基因表达和配对的空间转录组学以及bulk染色质可及性进行了全面的研究，揭示了上皮细胞异质性，并确定了可能导致PCa复发的潜在亚型。此外，该研究也探索了上皮细胞、免疫细胞生物学的时空动态，以及它们随肿瘤进展的功能转变。