技术背景

在过去的几年中，单细胞RNA-seq (scRNA-seq)在人和小鼠细胞中广泛应用并取得重大进展。然而，微生物学的绝大多数研究仍然依赖于平均数千甚至数百万个细菌的批量测量，主要关注整个微生物群体的平均行为，忽略了单个微生物细胞之间的差异。

单细胞微生物转录组技术是一种在单个微生物细胞水平上检测基因表达。通过分离单个微生物细胞，提取并扩增其RNA，结合高通量测序技术，能够全面分析每个细胞的转录组信息，从而揭示了微生物个体之间的功能和表达差异。为探索微生物的生理状态、代谢途径及细胞间相互作用提供了有力工具。

应用场景

细菌耐药性研究

通过分析单个细菌细胞的转录组水平，识别出与耐药性相关的关键基因和通路，如抗生素降解酶、外排泵和细胞壁修饰相关基因的表达变化。此外，可通过对耐药菌进行聚类分群分析，识别出具有高耐药潜力的细胞亚群，为理解耐药性的产生和传播机制提供新的视角。

环境压力下细菌进化研究

重金属和消毒剂等环境压力会对细菌造成严重的生理胁迫，而细菌通过进化适应机制发展出多种生存策略。单细胞微生物转录组技术能够在单个微生物水平上揭示这些策略的分子基础，为理解细菌的环境适应性和进化机制提供实验数据支持。

病原菌研究

(1) 通过对单个微生物转录水平分析，可以揭示病原菌在感染过程中不同亚群的基因表达异质性，识别出与宿主定植、免疫逃逸和毒力相关的关键基因。

(2) 分析患者体内病原菌的单个微生物转录组，识别出耐药基因的表达模式、激活状态以及细菌亚群的分布特征，为临床治疗提供针对性方案。

工业菌研究

(1) 探究益生菌功能因子表达机制，揭示不同亚群在功能表达上的异质性，从而深入理解益生菌的生理状态和功能调控网络。

(2) 明晰酿酒工程菌株风味形成原理，阐明不同微生物亚群对风味物质合成的贡献。

噬菌体相关研究

研究噬菌体-细菌互作，揭示细菌在噬菌体感染过程中的基因表达变化，识别出与噬菌体吸附、复制和裂解相关的关键基因，辅助噬菌体疗法疗效评价.

技术优势

1.稳定可靠

多通道高通量；重复性好，批间差小，数据有保证

2.性能优越

细菌多包率＜5%；细菌捕获率可达50%；有效细菌数＞2000

3.系统全面

单个细菌检测基因数中位数＞100

4.配套完善

特配生信软件，数据分析高效深入；试剂盒组分完整

单细胞微生物转录组技术流程

(1) 细菌单细胞悬液制备：摇菌至对数生长期（无生长时期要求的样本），测量OD600值。

(2) 细菌固定和透化：利用4%的固定液4℃旋转过夜固定细菌，让RNA与蛋白质交联，停止基因表达并减少RNA降解。利用细胞裂解液裂解细胞壁并用细胞透膜剂对细菌细胞膜进行通透化处理，便于后续试剂进入胞内进行反应。

(3) 细菌原位逆转录：细菌细胞内进行逆转录，mRNA逆转录得到一链cDNA。

(4) 细菌内cDNA 3加A尾：利用酶接法在一链cDNA的3端加上poly A结构，便于后续进行mRNA捕获。

(5) 液滴生成及液滴内反应：液滴包裹单个细菌和单个微球，在液滴内进行cDNA二链合成，同时利用微球上的分子标签对cDNA进行标记。

(6) 破乳、cDNA富集和建库测序：打破液滴，收集cDNA，利用磁珠将富集后的DNA纯化，通过PCR扩增纯化后DNA两端添加测序引物及index，同时进行DNA富集。利用PE150对文库进行测序。

数据分析流程

数据分析是从原始测序数据提取生物学信息的关键步骤。这一环节包括数据质控、细胞聚类与注释、差异基因表达分析等步骤，同时灵思生物也可进行病毒&质粒分析、耐药&毒力基因分析、拟时序分析等。目的是揭示细胞间的生物群体中的基因表达异质性和功能多样性，为深入理解微生物的生理状态、代谢途径及细胞间相互作用提供关键见解。

未来与挑战

1. 技术灵敏度：提高检测的灵敏度和全面性，仍然是技术发展的关键挑战。

2. 技术成本：突破技术难点，降低实验检测成本。

3. 未来方向：将在多组学整合，算法优化；扩增在感染性疾病方面的研究。