单细胞测序和免疫检查点抑制剂

单细胞转录组测序（ Single -cell RNA -sequencing）是指在单细胞水平上对 RNA进行高通量测序和分析的新技术。同种细胞会由于所处的生理状态出现差异表达，常规的 bulk RNA（bulk就是我们测的是所有细胞的总RNA（mRNA）取平均值代表每个基因的表达量。）并不能捕获这种差异表达，而这种差异又代表着表型背后的原理，为了捕获这种差异，单细胞测序技术应运而生。不同于常规组织或细胞群测序得到的结果（只是大量细胞平均表达水平），单测序能够深入挖掘特异性的信息。目前，单细胞测序已广泛应用于肿瘤异质性、免疫微环境、神经科异质性、免疫微环境神经科 、胚胎发育细胞分化等领域的研究。

免疫检查点抑制剂（ Immune checkpoint inhibitor, ICI ）：免疫检查点是一类免疫抑制性的分子，可以调节免疫反应的强度和广度，从而避免正常组织的损伤和破坏，在肿瘤的发生、发展过程中，免疫检查点成为免疫耐受的主要原因之一。免疫检查点抑制剂就是通过抑制免疫检查点以调节T细胞活性来杀伤肿瘤细胞。

免疫相关不良事件（immune-related adverse events, irAEs）是因免疫系统过度激活而引起，表现为多器官炎症，严重时会危及患者生命。

使用单细胞RNA测序技术检测癌症患者外周血T细胞，并结合细胞转录组索引和表位测序(CITEseq)方法，了解在ICI治疗过程中以及通过irAEs发作而产生的T细胞反应的生物学特性。定义与T细胞从自我耐受到致敏效应细胞转变相关的分子和细胞变化，可以为器官特异性irAEs的机制研究提供基础。

推荐文章：Single-cell RNA sequencing reveals distinct T cell populations in immune-related adverse events of checkpoint inhibitors. 2023 Jan 17;4(1):100868. doi: 10.1016/j.xcrm.

联合分析思路（技术路线）：

结果展示：用降维方法可视化raes患者的scRNAseq数据

(A)研究设计示意图工作流程；

(B)患者的临床特征；

(C和D)来自irAEs患者和非irAEs患者的135,287个T细胞的UMAP (C)和KNetL投影(D)；

(E)无irAEs和irAEs患者队列中基线和治疗后T细胞百分比变化(配对T检验)。*p<0.05, **p <0.01, ***p<0.001.

结果展示：基于基因标记的簇注释识别外周T细胞的效应亚群、调节亚群和记忆亚群

(A和B) KNetL根据CD8A表达水平绘制的集群示意图，相应的热图显示CD8A集群中选定标记物的表达(红色字体的CD45RA表示基于cite -seq的蛋白表达)(A)和CD4集群(B)。

(C)热图点阵图显示T细胞状态与基于相对签名评分变量的集群之间的关联。

(D)点阵图显示了基于标记基因评分的无irAEs患者和有irAEs患者队列之间T细胞状态的比较(未配对T检验)。****p < 0.0001.

结果展示：免疫相关性关节炎患者在基线时CD4 TH细胞百分比较高

(A)带有注释的CD4 T细胞簇的代表性KNetL图。

(B)不同临床结果:关节炎、肺炎和甲状腺炎基线时6个CD4 T细胞亚群的平均细胞百分比(未配对T检验)。

(C)火山图突出了关节炎患者第25组中上调和下调的基因，配对点图比较了无irae组和关节炎组中上调基因的RNA表达。

(D和E)基因本体论(GO)对来自免疫系统的关节炎患者的25簇中存在的差异基因进行分析。

(F)利用综合KEGG-String平台对关节炎患者第25簇中差异表达基因的通路分析。

结果展示：选定的CD4 TH细胞亚群与器官特异性irae相关

(A)具有代表性的第14类KNetL图，每位患者和不同疾病组(关节炎、肺炎和甲状腺炎)中throrc + IL21+细胞的平均百分比差异

(B) C14细胞亚簇分为6个亚簇:sC1-sC6。代表性基因分别显示。

(C)热图显示TH2和TH17家族细胞中不同亚簇相关标记的表达。黑色箭头表示子集定义标记。

(D)基线时临床irAE组间的差异聚类。irAE组和非irAE组中sC3、sC4、sC2三个簇细胞百分比的定量分析。为每个非irae组选择的患者是根据潜在肿瘤的类型进行选择的。

(E)基于富集评分的候选基因标记与TH2和th1723簇的相关性和RNA表达图。代表性的KNetL图显示了候选基因标记物KLF6、S100B和SIGLEC14的表达，指明了肺炎和甲状腺炎中存在的预测细胞群。

结果展示：炎性关节炎患者CD8 TCM 细胞在基线水平较低

(A)带注释的CD8 T细胞簇的代表性KNetL图。

(B)六个CD8 T细胞亚群在不同临床结局中的平均细胞百分比:基线时的关节炎、肺炎和甲状腺炎(未配对T检验)。

(C)火山图，突出了无irAEs患者TCM CXCR3+细胞中上调和下调的基因。

(D)氧化石墨烯(GO)分析无irAEs患者的TCM  CXCR3+细胞中存在的差异基因(来自Immune.MSigDB的富集项)。

(E)线形图显示了基于T抑制细胞特征评分的无irAEs患者和关节炎患者队列之间T细胞状态的比较。

(F)利用综合KEGG-String平台对无irAEs患者TCM  CXCR3+细胞差异表达基因的通路分析。

(G) 19例患者的流式细胞术数据量化，显示基线时初始、中枢记忆(CM)、效应记忆(EM)和终末分化T细胞(TEMRA)的百分比。

结果展示：炎性关节炎患者CD8 TCM 细胞在基线水平较低

(A)带注释的CD8 T细胞簇的代表性KNetL图。

(B)六个CD8 T细胞亚群在不同临床结局中的平均细胞百分比:基线时的关节炎、肺炎和甲状腺炎(未配对T检验)。

(C)火山图，突出了无irAEs患者TCM CXCR3+细胞中上调和下调的基因。

(D)氧化石墨烯(GO)分析无irAEs患者的TCM CXCR3+细胞中存在的差异基因(来自Immune.MSigDB的富集项)。

(E)线形图显示了基于T抑制细胞特征评分的无irAEs患者和关节炎患者队列之间T细胞状态的比较。

(F)利用综合KEGG-String平台对无irAEs患者TCM CXCR3+细胞差异表达基因的通路分析。

(G) 19例患者的流式细胞术数据量化，显示基线时初始、中枢记忆(CM)、效应记忆(EM)和终末分化T细胞(TEMRA)的百分比。

结果展示：免疫相关性肺炎患者具有独特的T细胞群分布

(A)慢性过敏性肺炎(CHP)和组织性肺炎(OP)患者在基线和治疗时的代表性胸部CT扫描。

(B)具有代表性的KNetL图，指示用于区分肺炎组的关键聚类。

(C) CHP患者细胞富集在C10、C3和C4簇。

(D) OP患者的细胞在C22和C25簇中被耗尽。

(E)量化不同肺炎组间cd3t细胞亚群的平均百分比差异。

(F)热图显示C10、C22和C25集群中CHP组和OP组之间差异表达基因的RNA表达。