研究背景：

        尤文肉瘤(ewing’s sarcoma)是小圆形细胞的低分化的恶性肿瘤。它占所有原发性骨肿瘤的6%～8%，是儿童和青少年最常见的恶性原发性骨肿瘤之一。肿瘤多发生于骨干部，从骨干中央向干骺端蔓延，自骨肉向外破坏，肿瘤呈结节状，质地柔软，无包膜。瘤细胞呈圆形或多角形，形态相当一致，胞浆很少，染色浅，胞膜不清楚。细胞核呈圆形或椭圆形，大小比较一致，颗粒细，分布均匀，核分裂相多见。这种疾病的特征是FET基因家族（主要为EWSR1）与ETS(E-twenty six)基因家族（主要是 FLI1 或 ERG）之间的标志性基因融合。在所有患者中，分别有85%和10-15%分别检测到EWSR1–FLI1 或 EWSR1–ERG 融合转录本。

尤文肉瘤的治疗包括手术、局部放疗和化疗的结合诊断为局限性疾病的患者的生存率约为70%，但转移性疾病患者的生存率下降到约30%，难治性疾病的生存率约为10%，这几十年没有变化。目前已有免疫治疗成功应用于某些成人实体癌症，但在儿科癌症的应用偏少，免疫治疗的成功依赖于发现针对目标癌症且在正常组织中表达最少的强候选表面标记。

为寻找在临床治疗尤文肉瘤的免疫治疗靶点，有研究者选取了13个细胞系异种移植（CDX）、6个组织异种移植（PDX），共计19个尤文肉瘤异种移植模型通过密度梯度超速离心法进行膜富集，采用串联质量标签方法（TMT）对尤文肉瘤表面蛋白组及相匹配的全蛋白组进行全面的定量蛋白质组学分析(图1)。将鉴定出的蛋白质通过Proteome Discoverer软件筛除小鼠源的蛋白质的干扰，后通过SurfaceGenie、COMPARTMENTS、GO分析等方法对检测到的蛋白质组进行归类以筛选区分表面蛋白。

图1 尤文肉瘤模型表面蛋白质富集方法

通过以上方法对尤文肉瘤模型进行蛋白质组学鉴定，在表面蛋白富集样本中共计鉴定出3357个蛋白质，其中1131个被归类为表面蛋白质；而全蛋白样本组共鉴定出6867个蛋白质，其中1030个被归类为表面蛋白(图2)。被鉴定出的表面蛋白有797个是两个样本公用的，有334个仅在表面蛋白富集样本中鉴定到。

图2 表面蛋白质组与全蛋白质组鉴定数量

为了帮助突出尤文肉瘤特异性表面蛋白，研究者制备了不同组织类型中人类蛋白质的 12 种常见细胞系的混合物(SM)，如A673、CHLA10、HEK293t等细胞系，并采用类似尤文肉瘤模型样本的处理方式进行处理，得到SM样本的表面蛋白质组和全蛋白质组。将尤文肉瘤模型两种蛋白质组所共有的蛋白质，与SM样本蛋白质组结果相对比，发现已知的尤文肉瘤相关蛋白包括CD99、IL1RAP、ADGRG2等，在表面蛋白质组和全蛋白质组的表达情况相对SM样本均有提升（图3）。

图3 表面蛋白质组与全蛋白质组差异倍数值变化（尤文肉瘤模型与SM样本对比）

根据SM样本和尤文肉瘤模型中蛋白质组鉴定情况对比，分别绘制表面蛋白质组及全蛋白质组火山图（图4）。根据火山图显示，在表面蛋白质组中鉴定的3357种蛋白质中的194种在尤文肉瘤模型中有明显上调，其中49种被归类为表面蛋白，另外145种被归类为非表面蛋白，表面蛋白占比25%（图4D）；而在全蛋白质组中鉴定的6867种蛋白质中的1349种在尤文肉瘤模型中有明显上调，其中120种被归类为表面蛋白，另外1229种被归类为非表面蛋白，表面蛋白占比9%（图4E）。而已知与尤文肉瘤相关的膜蛋白包括 IL1RAP、ADGRG2、NGFR 和 CD99等，也均在明显上调的蛋白质中。

图4 表面蛋白质组（D）和全蛋白质组（E）中尤文肉瘤模型鉴定所有蛋白质火山图

为进一步筛选出适合作为免疫治疗的靶点，研究者结合SurfaceGenie、Uniprot等数据库中的相关数据，拟定了一套对筛选出的蛋白质是否适合作为免疫治疗靶点的评分方案及标准（图5A-B），并根据评分方案将筛选出218种蛋白质按分数进行排序（图5C）。目前排序结果第一梯队中的IL1RAP、ADGRG2和LINGO1已有报道称处于临床开发阶段，进一步验证了筛选数据的准确性。

图5 根据尤文肉瘤表面蛋白质组和全蛋白质组数据确定免疫治疗潜在靶点顺序

评分排序结果中排在第一梯队中的39种蛋白质，有部分尚未被认为是尤文肉瘤的候选免疫治疗靶点，且他们在正常组织样本中的表达量较低。

根据现今研究进展，外核苷酸焦磷酸酶/磷酸二酯酶1(ENPP1)已被证明在癌症转移和免疫逃避中具有潜在作用，虽然尚未在尤文肉瘤方面进行广泛研究，但根据ENPP1在蛋白质及RNA水平上均表现出尤文肉瘤高表达（图6A）；而钙粘蛋白 11 (CDH11)已有报道认为与尤文肉瘤转移有关。且根据数据库信息信息，发现ENPP1和 CDH11均表现出良好的细胞外氨基酸暴露情况，是设计基于抗体的免疫治疗的重要特征之一。因此研究者选择ENPP1和CDH11两个蛋白质，进一步评估它们作为潜在免疫治疗靶点的可行性。

图6 实验验证ENPP1和 CDH11 在尤文肉瘤免疫治疗中的可行性

为进一步验证，研究者对尤文肉瘤中ENPP1和CDH11蛋白含量进行了WB检测，结果显示在尤文肉瘤中ENPP1和CDH11的表达有显著上升（图6B）。对全细胞裂解液和细胞膜提取液中ENPP1同时进行WB检测中，发现ENPP1在细胞膜呈现高表达（图6C）；研究者通过细胞免疫荧光检测ENPP1和CDH11在细胞的表达及定位情况（图6D），检测结果显示两种蛋白质均主要在细胞膜上表达。通过IHC实验对实体瘤进行测，结果显示在尤文肉瘤组织中的ENPP1表达量明显高于其他儿童肉瘤（图6E）。另外，研究者选取了正常儿科组织进行IHC检测对比，实验结果显示除在正常胰腺和肝脏中检测到低至中度染色外，其余样本均未检测到明显染色信号（图6F）。

根据以上实验数据，表明CDH11 和 ENPP1 在尤文肉瘤模型中均出现高表达，且在正常组织中的表达量极少，是潜在的免疫治疗靶点。同时也证明了蛋白质组学在筛选潜在靶点的潜力与实用性。